La inmunoprecipitación de cromatina ( ChIP ) es un tipo de técnica experimental de inmunoprecipitación que se utiliza para investigar la interacción entre las proteínas y el ADN en la célula. Su objetivo es determinar si proteínas específicas están asociadas con regiones genómicas específicas, como factores de transcripción en promotores u otros sitios de unión al ADN , y posiblemente definir cistromas . ChIP también tiene como objetivo determinar la ubicación específica en el genoma con la que están asociadas varias modificaciones de histonas , indicando el objetivo de los modificadores de histonas. [1] ChIP es crucial para los avances en el campo de la epigenómica y para aprender más sobre los fenómenos epigenéticos. [2]
Brevemente, el método convencional es el siguiente:
El ADN y las proteínas asociadas en la cromatina de células o tejidos vivos están entrecruzados (este paso se omite en Native ChIP).
Los complejos de ADN-proteína (cromatina-proteína) luego se cortan en fragmentos de ADN de aproximadamente 500 pb mediante sonicación o digestión con nucleasa.
Los fragmentos de ADN reticulado asociados con la(s) proteína(s) de interés se inmunoprecipitan selectivamente a partir de los restos celulares utilizando un anticuerpo específico de proteína apropiado.
Los fragmentos de ADN asociados se purifican y se determina su secuencia. El enriquecimiento de secuencias de ADN específicas representa regiones del genoma con las que está asociada la proteína de interés in vivo .
ChIP reticulado es adecuado principalmente para mapear el ADN objetivo de factores de transcripción u otras proteínas asociadas a la cromatina, y utiliza cromatina reticulada reversible como material de partida. El agente para la reticulación reversible podría ser formaldehído [3] o luz ultravioleta . [4] Luego, la cromatina reticulada generalmente se corta mediante sonicación, proporcionando fragmentos de 300 a 1000 pares de bases (pb) de longitud. Se ha utilizado una reticulación suave con formaldehído seguida de digestión con nucleasa para cortar la cromatina. [5] Los fragmentos de cromatina de 400 a 500 pb han demostrado ser adecuados para ensayos ChIP ya que cubren de dos a tres nucleosomas .
Luego, los restos celulares del lisado cortado se eliminan mediante sedimentación y los complejos proteína-ADN se inmunoprecipitan selectivamente utilizando anticuerpos específicos contra las proteínas de interés. Los anticuerpos suelen estar acoplados a agarosa , sefarosa o perlas magnéticas. Alternativamente, los complejos de cromatina-anticuerpo se pueden retener y eluir selectivamente mediante discos de polímero inertes. [6] [7] Los complejos inmunoprecipitados (es decir, el complejo perla-anticuerpo-proteína-secuencia de ADN objetivo) luego se recolectan y se lavan para eliminar la cromatina unida no específicamente, se invierte el entrecruzamiento proteína-ADN y se eliminan las proteínas. por digestión con proteinasa K. Se puede utilizar una versión marcada con epítopo de la proteína de interés, o biotinilación in vivo [8] en lugar de anticuerpos contra la proteína nativa de interés.
Native ChIP es adecuado principalmente para mapear el objetivo de ADN de los modificadores de histonas . Generalmente, se utiliza cromatina nativa como cromatina inicial. A medida que las histonas se envuelven alrededor del ADN para formar nucleosomas, están unidas de forma natural. Luego, la cromatina se corta mediante digestión con nucleasa microcócica, que corta el ADN a lo largo del conector, dejando los nucleosomas intactos y proporcionando fragmentos de ADN de un nucleosoma (200 pb) a cinco nucleosomas (1000 pb) de longitud. Posteriormente, se utilizan métodos similares a XChIP para eliminar los restos celulares, inmunoprecipitar la proteína de interés, eliminar la proteína del complejo inmunoprecipitado y purificar y analizar el ADN asociado al complejo. [ cita necesaria ]
Comparación de XChIP y NChIP
La principal ventaja de NChIP es la especificidad de los anticuerpos . Es importante señalar que la mayoría de los anticuerpos contra las histonas modificadas se generan contra antígenos peptídicos sintéticos no fijados y que los epítopos que necesitan reconocer en el XChIP pueden alterarse o destruirse mediante entrecruzamiento con formaldehído , particularmente porque es probable que los entrecruzamientos involucran grupos e-amino de lisina en los N-terminales, alterando los epítopos. Es probable que esto explique la baja eficiencia de los protocolos XChIP en comparación con NChIP.
Pero XChIP y NChIP tienen diferentes objetivos y ventajas entre sí. XChIP sirve para mapear sitios objetivo de factores de transcripción y otras proteínas asociadas a la cromatina; NChIP sirve para mapear sitios objetivo de modificadores de histonas (consulte la Tabla 1).
Comparación de ChIP-seq y ChIP-chip
La secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina, también conocida como ChIP-seq , es una técnica experimental utilizada para identificar eventos de unión de factores de transcripción en todo un genoma . Saber cómo las proteínas del cuerpo humano interactúan con el ADN para regular la expresión genética es un componente clave de nuestro conocimiento de las enfermedades humanas y los procesos biológicos. ChIP-seq es la técnica principal para completar esta tarea, ya que ha demostrado ser extremadamente eficaz para resolver cómo las proteínas y los factores de transcripción influyen en los mecanismos fenotípicos. En general, ChIP-seq se ha convertido en un método muy eficiente para determinar estos factores, pero existe un método rival conocido como ChIP-on-chip.
ChIP-on-chip , también conocido como ChIP-chip, es una técnica experimental utilizada para aislar e identificar sitios genómicos ocupados por proteínas específicas de unión al ADN en células vivas. ChIP-on-chip es una técnica relativamente nueva, ya que fue introducida en 2001 por Peggy Farnham y Michael Zhang. ChIP-on-chip recibe su nombre al combinar los métodos de inmunoprecipitación de cromatina y microarrays de ADN , creando así ChIP-on-chip.
Los dos métodos buscan resultados similares, ya que ambos se esfuerzan por encontrar sitios de unión a proteínas que puedan ayudar a identificar elementos en el genoma humano. Esos elementos del genoma humano son importantes para el avance del conocimiento sobre las enfermedades humanas y los procesos biológicos. La diferencia entre ChIP-seq y ChIP-chip se establece por el sitio específico de identificación de unión a proteínas. La principal diferencia proviene de la eficacia de las dos técnicas: ChIP-seq produce resultados con mayor sensibilidad y resolución espacial debido a la amplia gama de cobertura genómica. Aunque ChIP-seq ha demostrado ser más eficiente que ChIP-chip, ChIP-seq no siempre es la primera opción para los científicos. El costo y la accesibilidad de ChIP-seq es una desventaja importante, lo que ha llevado al uso más predominante de ChIP-chip en laboratorios de todo el mundo. [2]
Esta foto compara la eficacia de las dos técnicas experimentales, ChIP-seq y ChIP-chip.
Tabla 1 Ventajas y desventajas de NChIP y XChIP
Historia y nuevos métodos ChIP
En 1984, John T. Lis y David Gilmour, en ese momento estudiante de posgrado en el laboratorio de Lis, utilizaron irradiación UV, un agente reticulante de proteína y ácido nucleico de longitud cero, para entrecruzar covalentemente proteínas unidas al ADN en células bacterianas vivas. Después de la lisis de células entrecruzadas y la inmunoprecipitación de la ARN polimerasa bacteriana, el ADN asociado con la ARN polimerasa enriquecida se hibridó con sondas correspondientes a diferentes regiones de genes conocidos para determinar la distribución in vivo y la densidad de la ARN polimerasa en estos genes. Un año más tarde, utilizaron la misma metodología para estudiar la distribución de la ARN polimerasa II eucariota en los genes de choque térmico de la mosca de la fruta. Estos informes se consideran estudios pioneros en el campo de la inmunoprecipitación de cromatina. [9] [10] XChIP fue modificado y desarrollado aún más por Alexander Varshavsky y sus compañeros de trabajo, quienes examinaron la distribución de la histona H4 en genes de choque térmico utilizando entrecruzamiento de formaldehído. [11] [12] Esta técnica se desarrolló y perfeccionó ampliamente a partir de entonces. [13]
El enfoque NChIP fue descrito por primera vez por Hebbes et al ., 1988, [14] y también se ha desarrollado y perfeccionado rápidamente. [15] El ensayo ChIP típico suele tardar entre 4 y 5 días y requiere al menos 10 6 ~ 10 7 células. Ahora se pueden lograr nuevas técnicas en ChIP con tan solo 100 ~ 1000 células y completarse en un día.
ChIP sin cuentas : este novedoso método ChIP utiliza discos de polímero poroso e inerte funcionalizados con proteína A o G en columnas de centrifugación o microplacas. El disco retiene selectivamente el complejo cromatina-anticuerpo y eluye para obtener ADN enriquecido para aplicaciones posteriores como qPCR y secuenciación. El entorno poroso está diseñado específicamente para maximizar la eficiencia de captura y reducir la unión no específica. Debido a un menor manejo manual y protocolos optimizados, ChIP se puede realizar en 5 horas. [7]
ChIP portador (CChIP): este enfoque podría usar tan solo 100 células agregando células de Drosophila como cromatina portadora para reducir la pérdida y facilitar la precipitación de la cromatina objetivo. Sin embargo, requiere cebadores altamente específicos para la detección de la cromatina de la célula diana a partir del fondo de cromatina portadora extraña, y lleva de dos a tres días. [dieciséis]
Fast ChIP (qChIP): el ensayo de ChIP rápido redujo el tiempo al acortar dos pasos en un ensayo de ChIP típico: (i) un baño ultrasónico acelera la velocidad de unión de los anticuerpos a las proteínas diana y, por lo tanto, reduce el tiempo de inmunoprecipitación (ii) una resina- El procedimiento de aislamiento de ADN basado en (Chelex-100) reduce el tiempo de reversión del entrecruzamiento y aislamiento del ADN. Sin embargo, el protocolo rápido sólo es adecuado para muestras de células grandes (en el rango de 10 6 ~ 10 7 ). [17] [18] Se pueden procesar hasta 24 muestras de cromatina cortadas para producir ADN listo para PCR en 5 horas, lo que permite sondear múltiples factores de cromatina simultáneamente y/o observar eventos genómicos en varios puntos de tiempo. [19]
ChIP rápido y cuantitativo (Q 2 ChIP): el ensayo utiliza 100 000 células como material de partida y es adecuado para hasta 1000 ChIP de histonas o 100 ChIP de factores de transcripción. Por lo tanto, se pueden preparar y almacenar muchas muestras de cromatina en paralelo, y se puede realizar Q 2 ChIP en un día. [20]
MicroChIP (μChIP): la cromatina se suele preparar a partir de 1.000 células y se pueden preparar hasta 8 ChIP en paralelo sin portadores. El ensayo también puede comenzar con 100 células, pero solo es adecuado para un ChIP. También se pueden utilizar biopsias de tejido pequeñas (1 mm 3 ) y se puede realizar microChIP en un día. [21] [22]
Matrix ChIP : se trata de un ensayo de ChIP basado en microplacas con mayor rendimiento y un procedimiento simplificado. Todos los pasos se realizan en pocillos de microplacas sin transferencias de muestras, lo que permite un potencial de automatización. Permite realizar 96 ensayos de ChIP para histonas y varias proteínas unidas al ADN en un solo día. [23]
Pathology-ChIP (PAT-ChIP): Esta técnica permite ChIP a partir de tejidos patológicos fijados con formalina e incluidos en parafina y, por lo tanto, el uso de archivos de patología (incluso aquellos que tienen varios años de antigüedad) para análisis epigenéticos y la identificación de biomarcadores epigenéticos candidatos o objetivos. [24]
Los ensayos a gran escala que utilizan ChIP son un desafío si se utilizan organismos modelo intactos. Esto se debe a que se deben generar anticuerpos para cada TF o, alternativamente, se deben producir organismos modelo transgénicos que expresen TF etiquetados con epítopos.
Los investigadores que estudian patrones diferenciales de expresión genética en organismos pequeños también enfrentan problemas debido a que los genes se expresan en niveles bajos, en una pequeña cantidad de células y en una ventana de tiempo estrecha.
Los experimentos de ChIP no pueden discriminar entre diferentes isoformas de TF ( isoforma de proteína ).
Ver también
ChIP-exo , una técnica que agrega tratamiento con exonucleasa al proceso ChIP para obtener una resolución de los sitios de unión de hasta un solo par de bases
ChIP-on-chip , combina ChIP con tecnología de microarrays
DamID , una técnica alternativa de mapeo de localización que no requiere anticuerpos específicos
RIP-Chip , una técnica similar para analizar interacciones ARN-proteína
Referencias
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enlaces externos
Wikimedia Commons tiene medios relacionados con la inmunoprecipitación de cromatina .
