La isoforma épsilon de la caseína quinasa I o CK1ε, es una enzima codificada por el gen CSNK1E en humanos. [5] [6] Es el homólogo mamífero de doubletime . CK1ε es una proteína quinasa de serina/treonina y está muy conservada; por lo tanto, esta quinasa es muy similar a otros miembros de la familia de la caseína quinasa 1 , [7] de la cual hay siete isoformas mamíferas (α, β, γ1, γ2, γ3, δ y ε). [8] CK1ε es más similar a CK1δ en estructura y función ya que las dos enzimas mantienen una alta similitud de secuencia en sus dominios reguladores C-terminal y catalítico . [8] Este gen es un componente principal del oscilador mamífero que controla los ritmos circadianos celulares . [7] La CK1ε también se ha visto implicada en la modulación de diversos problemas de salud humana, como el cáncer, las enfermedades neurodegenerativas y la diabetes. [8]
En los hámsteres, la mutación CK1ε-tau fue descubierta por primera vez por Michael Menaker y Martin Ralph en 1988 mientras estudiaban un envío de hámsteres sirios de laboratorio . [9] Observaron un hámster con un período circadiano anormal y, después de la cría y una caracterización adicional, los dos se dieron cuenta de que la mutación en los hámsteres confería un período de funcionamiento libre más corto de lo normal. [9] Atribuyeron este fenotipo a lo que denominaron la "mutación tau", que fue la primera descripción completa de un mutante circadiano de mamífero. [10] Este descubrimiento proporcionó una herramienta para que otros científicos realizaran investigaciones sobre los relojes biológicos y fue un importante desarrollo temprano en el campo. [11]
En 1995, el laboratorio Virshup de la Universidad de Utah aisló y clonó por primera vez la forma humana de CK1ε. [12] [13] Se identificó oficialmente como una isoforma de la familia de la caseína quinasa 1. [12] [13] Se han encontrado tres variantes de transcripción que codifican la misma proteína para este gen en ratas: CK1ε1, CK1ε2 y CK1ε3; y se han encontrado dos en humanos. [14] [15]
En 2000, el gen CK1ε fue posteriormente mapeado e identificado por Joseph Takahashi y colegas, quienes, utilizando análisis de diferencia representacional dirigido genéticamente, descubrieron que la mutación tau estaba ubicada en el gen CK1ε. [11] Se encontró que el gen CK1ε era similar al gen doubletime en Drosophila , [11] que había sido caracterizado e incorporado por primera vez en la función del reloj biológico por Michael Young y colegas en 1998. [16] En humanos, el gen CSNK1E se localiza en 22q13.1 y consta de 12 exones . [15]
En 2012 , Alexander Long y sus colegas realizaron imágenes estructurales de CK1ε mediante cristalografía de rayos X. [8] Posteriormente se confirmaron ciertos motivos estructurales relacionados con la quinasa, como un motivo de giro de cadena β-cadena β que ancla el ATP, un motivo DFG que orienta los fosfatos del ATP, un bucle catalítico que se asemeja al de la PKA y los principales sitios de reconocimiento de sustrato en el dominio C-terminal. [8]
Las estructuras tridimensionales de los dominios catalíticos de la CK1δ y CK1ε de mamíferos se resolvieron por primera vez mediante cristalografía de rayos X en 1996 y 2012 respectivamente. [8] La quinasa CK1 tiene múltiples isoformas, incluidas un total de siete isoformas caracterizadas en mamíferos (alfa, beta, gamma1-3, delta y épsilon). [17] Las diferentes isoformas difieren principalmente en la longitud y la estructura de su región no catalítica C-terminal. [17] Solo se ha demostrado que las isoformas delta y épsilon desempeñan un papel importante en la regulación del ritmo circadiano. [8]
CK1δ y CK1ε comparten un patrón muy similar en sus estructuras. [17] El bucle P rico en glicina se encuentra entre las cadenas β1 y β2, formando un motivo clásico de cadena β-vuelta-cadena β que ancla y sujeta el fosfato alfa de ATP. [8] CK1δ/ε además comparten características conservadas dentro del dominio catalítico , que se componen de un lóbulo N-terminal y un lóbulo C-terminal α-helicoidal. [8] El centro catalítico se encuentra en la región hendida entre los dos lóbulos, que también se asocia con el nucleótido y el sustrato. [8] Todos los inhibidores conocidos se unen a este centro, bloqueando la unión de ATP. [17]
La proteína codificada por el gen de la caseína quinasa 1 épsilon es una proteína quinasa de serina/treonina y un miembro de la familia de proteínas de la caseína quinasa I, cuyos miembros han sido implicados en el control de procesos citoplasmáticos y nucleares , incluyendo la replicación y reparación del ADN . [15] Al igual que otros miembros de la familia de proteínas de la caseína quinasa 1, la caseína quinasa 1 épsilon reconoce el motivo Ser (p)XXSer/ Thr para la fosforilación . [18] Se encuentra en el citoplasma como un monómero y puede fosforilar una variedad de proteínas, incluida ella misma. [15] Esta autofosforilación ocurre en el dominio C-Terminal de la proteína , una región que se cree que se comporta como un pseudosustrato , e inhibe la actividad de la quinasa. [7] [19] [20]
La proteína caseína quinasa 1 épsilon es parte del oscilador de mamíferos , un grupo de proteínas que mantienen a las células en un horario de aproximadamente 24 horas. [21] Este oscilador, o "reloj circadiano", está formado por un bucle de retroalimentación de transcripción-traducción (TTFL) en el que varias proteínas trabajan en tándem, cada una regulando la expresión de las demás para generar un ciclo de aproximadamente 24 horas de niveles de ARNm y proteína. [22] El TTFL también genera ritmos de aproximadamente 24 horas de resultados, como los niveles de liberación de hormonas celulares. [23] Se han observado oscilaciones diarias en la transcripción de proteínas y ARNm en muchas células, incluido el reloj maestro de mamíferos conocido como núcleo supraquiasmático (SCN). [24] Sin embargo, a diferencia de la mayoría de las proteínas del ritmo circadiano que oscilan en su expresión, la caseína quinasa 1 épsilon es constitutivamente activa. [23]
Las proteínas centrales que componen el TTFL de los mamíferos incluyen Period (PER), Cryptochrome (CRY), BMAL1 , CLOCK y caseína quinasa 1 épsilon. [25] BMAL1 y CLOCK trabajan para aumentar la transcripción de PER y CRY formando un heterodímero y uniéndose al dominio E-box aguas arriba de las secuencias codificantes de los genes PER y CRY. [25] Los niveles de PER y CRY están regulados por retroalimentación negativa, lo que significa que reprimen su propia transcripción. [25] La fosforilación de las proteínas PER por CK1ε tanto en el citoplasma como en el núcleo marca estas proteínas para su degradación. [26] La fosforilación también obstaculiza la capacidad de PER de entrar en el núcleo al inducir un cambio conformacional en su secuencia de localización nuclear . [7] [27] [28] Por otro lado, el complejo proteico FBXL3 media la degradación de las proteínas CRY en el citoplasma y el núcleo. [29] [30] Si CRY se une a PER antes de que sea fosforilada por CK1ε, estas tres proteínas se estabilizan en un complejo que puede ingresar al núcleo. [7] Una vez dentro del núcleo, PER y CRY trabajan para inhibir su propia transcripción mientras que la caseína quinasa 1 épsilon trabaja para modular la actividad de BMAL1 y CLOCK a través de la fosforilación. [7]
Como se dijo anteriormente, el dominio C-Terminal de la caseína quinasa 1 épsilon se comporta como un pseudosustrato cuando se fosforila, inhibiendo la actividad de la quinasa. [7] [19] [20] También se ha demostrado que el dominio C-Terminal es desfosforilado por fosfatasas como la proteína fosfatasa 1 (PP1) in vitro y en cultivo celular, que regula los niveles de caseína quinasa activa in vivo . [7] [22] [31] La teoría actual de los ritmos circadianos plantea la hipótesis de que este ciclo de fosforilación/desfosforilación de la caseína quinasa 1 épsilon es importante en la modulación del período de los ritmos circadianos en la célula, con una mayor fosforilación que disminuye la actividad de la caseína quinasa 1 épsilon (y posteriormente aumenta CRY y PER activos) y la desfosforilación de la caseína quinasa 1 épsilon da como resultado una quinasa más activa (y niveles más bajos de CRY y PER activos). [22]
En ratones, se ha demostrado que la caseína quinasa 1 épsilon fosforila tanto PER1 como PER2 , así como CRY1 y CRY2 . [23] La caseína quinasa 1 da como resultado una expresión cíclica de proteínas osciladoras de mamíferos, lo que da como resultado un cronometrador (oscilador de mamíferos) para la célula: [32]
El fenotipo prominente en los hámsteres mutantes tau CK1ε descubiertos por Menaker fue un período de ejecución libre inusualmente corto (22 horas en heterocigotos y 20 horas en homocigotos para la mutación), lo que hace que este alelo sea semidominante . [34] El gen CK1ε fue mapeado e identificado más tarde por Joseph Takahashi y colegas, lo que reveló una mutación sustitucional de un solo par de bases de C a T en el gen CK1ε del hámster. [35] Este polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) da como resultado una sustitución de arginina a cisteína en una región del dominio de reconocimiento de fosfato de CK1ε, una región altamente conservada del gen en los mamíferos. [35] Actualmente, no está claro cómo exactamente la mutación CK1ε-tau da como resultado un período de ejecución libre más corto. [36] Sin embargo, se ha sugerido que la mutación tau es una mutación de ganancia de función, que conduce a una mayor fosforilación de ciertos sitios PER, aumentando así la tasa de degradación de PER y acortando el período circadiano. [37] [21] La mutación CK1ε-tau en hámsteres fue la primera descripción completa de un mutante circadiano mamífero. [10]
En los seres humanos, las mutaciones que afectan el sitio de fosforilación de PER2 del gen CK1ε y/o CK1δ dan lugar al síndrome de la fase avanzada del sueño familiar (FASPS). [38] [39] Esta mutación, S662G, que da lugar a la pérdida de un único sitio aceptor de fosfato en PER2, impide que la proteína CK1ε se una a PER y conduce a un período circadiano inusualmente corto. [33]
Además, se ha identificado una mutación hereditaria en la CK1δ humana, T44A, como otra mutación que causa el acortamiento del período, y se ha identificado como otro mecanismo que causa el síndrome de fatiga crónica alcohólico fetal. [40] Esta mutación reduce la actividad de la CK1δ in vivo en humanos, y se ha demostrado de manera similar que hace lo mismo en ratones. [40] Sin embargo, experimentos en otras especies como las moscas han demostrado que esta mutación induce efectos de alargamiento del período. [40]
Además, en los seres humanos, se ha demostrado que las mutaciones P415A y H417R en PER3 desestabilizan la proteína. [41] Se ha demostrado que estas mutaciones generan FASPS y también están asociadas con una alteración de la regulación del estado de ánimo. [41]
La CK1δ/ε está compensada por la temperatura, una característica de muchos ritmos circadianos. [42] La capacidad de la CK1δ/ε para fosforilar sus sustratos permanece constante incluso cuando la temperatura fluctúa, mientras que las tasas de reacciones normales tienden a aumentar con el aumento de la temperatura. [42] Además, los mutantes tau de la CK1ε muestran una pérdida de compensación de temperatura. [42]
Se pueden encontrar dos homólogos funcionales del ritmo circadiano de esta proteína mamífera en Drosophila melanogaster (mosca de la fruta). [43] Los homólogos funcionales se refieren a proteínas que comparten una función similar en otro animal pero que no son necesariamente genéticamente similares .
Un gen, que codifica la proteína Doubletime (abreviado dbt ), cumple una función similar a la de la caseína quinasa 1 épsilon en cronobiología , ya que desempeña un papel en la fosforilación de PER . [7] [43] Sin embargo, su secuencia génica no muestra homología de secuencia. [7] [15] [43] [44] Además, la caseína quinasa 1 épsilon no rescata por completo los ritmos circadianos en los knockouts doubletime de la mosca de la fruta ( dbt -/- ), lo que sugiere que estas enzimas cumplen funciones similares, pero no idénticas. [45] [44]
Otro homólogo funcional, el gen de Drosophila para la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3), llamado shaggy y abreviado sgg, codifica una proteína que fosforila a Timeless (TIM), el homólogo funcional CRY de la mosca de la fruta . [46] Al igual que dbt , shaggy no es un homólogo de secuencia de la caseína quinasa 1 épsilon. [46] Por el contrario, Gsk3 también se encuentra en mamíferos, y los mutantes han sido implicados en anomalías del ritmo circadiano en pacientes que sufren trastorno bipolar . [7]
El genoma de Drosophila melanogaster contiene otras enzimas de la familia de la caseína quinasa 1, que se cree que no cumplen ninguna función circadiana. [47] Sin embargo, una enzima diferente de la familia de la caseína quinasa, la caseína quinasa 2 alfa, ha sido implicada en la provisión de la fosforilación inicial de un residuo de serina que es reconocido tanto por DBT como por Shaggy para la fosforilación secuencial de PER y TIM. [48] [49]
Aunque tradicionalmente se ha considerado que CK1ε es el principal regulador de la fosforilación de PER y CRY, se cree que la isoforma delta de la caseína quinasa 1 ( CK1δ o CSNK1D ), una isoforma , desempeña un papel similar en el TTFL. [21] Tanto CK1ε como CK1δ fosforilan y desestabilizan PER in vitro e interactúan con PER y CRY in vivo. [21] Además, se ha demostrado que CK1δ interactúa mejor con las proteínas del reloj molecular de la drosophila que CK1ε, lo que indica que CK1δ puede ser más homóloga a dbt que CK1ε. [21] Además, la espectrometría de masas ha demostrado que CK1δ es más de 20 veces más abundante que CK1ε en el hígado. [42]
Se cree que la fosforilación de PER2 está regulada por un mecanismo de fosfoswitch. [42] Específicamente, PER2 requiere una fosforilación de cebado inicial para ser fosforilada y posteriormente degradada por CK1δ y/o CK1ε. [42] De esta manera, las fosforilaciones temporalmente secuenciadas de PER2 actúan para retrasar su tasa de degradación y pueden proporcionar información sobre cómo se compensa la temperatura del reloj circadiano. [42] CK1δ y/o CK1ε pueden proporcionar la actividad de cebado. [42] El sitio FASP en PER2 es un objetivo clave de esta actividad de quinasa de cebado. [42] Las mutaciones en este sitio pueden afectar la capacidad de PER2 para recibir una fosforilación de cebado, lo que lleva a un alargamiento o acortamiento del período. [42] Otros estudios han sugerido que la fosforilación descendente de PER2 lleva a interacciones estabilizadoras que disminuyen la tasa de degradación de PER. [42] Se cree que esto aumenta el período del reloj circadiano. [42] Se cree que las mutaciones en el área de fosforilación de PER2 están relacionadas con los pacientes con FASPS [50]
La vía Wnt canónica implica la acumulación de β-catenina en el citoplasma, que activa factores de transcripción. [51] La caseína quinasa 1 épsilon y la caseína quinasa 1 delta relacionada se desfosforilan en esta vía. [51] [7] La desfosforilación de la caseína quinasa 1 épsilon probablemente se logra mediante la proteína fosfatasa 2 (PP2A), que aumenta la actividad quinasa de ambas enzimas in vivo. [7] La caseína quinasa 1 épsilon y la caseína quinasa 1 delta se han implicado en el aumento de la estabilidad de la β-catenina en el citoplasma, aunque los estudios del mecanismo para esta estabilización no son concluyentes. [52] La teoría actual sobre cómo funcionan la caseína quinasa 1 épsilon y/o la caseína quinasa 1 delta en esta vía es que ambas caseínas quinasas estabilizan directamente la β-catenina a través de una regulación positiva, o que estabilizan indirectamente la β-catenina a través de una regulación negativa del complejo de degradación de la β-catenina ( proteasa ). [7] [53]
Se sabe que la caseína quinasa 1 épsilon y delta fosforilan una proteína supresora de tumores , p53 , in vivo tanto en humanos como en ratones o ratas del viejo mundo. [7] [54] [55] [56] CK1 fosforila p53 en su extremo N para inducir su activación, lo que posteriormente aumenta la detención del ciclo celular y la apoptosis . [57] Se ha demostrado que el daño al ADN activa p53 a través de una mayor activación de CK1. [57] La inactivación de CK1 conduce a una menor resistencia a la apoptosis. [57]
La caseína quinasa 1 épsilon también está implicada como causante indirecta de cáncer a través de su regulación de la proteína asociada a Yes (YAP), un oncogén y regulador del tamaño de los órganos. [58] Después de la preparación a través de la fosforilación por la serina/treonina quinasa LATS , se ha demostrado que tanto la caseína quinasa 1 épsilon como la caseína quinasa 1 delta fosforilan YAP y la marcan para la ubiquitinación y degradación. [59]
Varios estudios han demostrado una conexión entre los componentes moleculares del reloj circadiano y los trastornos psiquiátricos, en particular el abuso de drogas. [60] Los estudios de asociación genética en humanos han implicado a CK1ε/CK1δ en el desarrollo de adicciones a la metanfetamina, la heroína y el alcohol. [60] Además, los estudios con ratones revelan un vínculo entre la actividad de CK1ε/CK1δ y el efecto estimulante producido por la metanfetamina. [60] Además, se ha demostrado que la inhibición de CK1ε/CK1δ en roedores disminuye la conducta de recaída del alcohol y los opiáceos durante la abstinencia. [61] [62]
Se ha demostrado que la caseína quinasa 1 épsilon interactúa con PER1 , [28] PER2 , CRY1 , CRY2 , BMAL1 , CLOCK , NPAS2 y AXIN1 . [7] [63] PER1, PER2 y BMAL1 pueden ser fosforilados directamente por CK1ɛ, mientras que PER3, CRY1 y CRY2 solo pueden ser fosforilados por CK1ɛ cuando se asocian con PER1 o PER2. [21]
Las empresas de biotecnología han producido varios inhibidores para facilitar la investigación sobre la función de la caseína quinasa 1 épsilon. Las pruebas realizadas con inhibidores de CK1ε han confirmado la participación de CK1ε en diversos procesos, especialmente en la regulación de los ritmos circadianos.
PF-670462, desarrollado por Pfizer , es un inhibidor bien caracterizado tanto de CK1ε como de CK1δ que ha demostrado alargar el período de los ritmos circadianos cuando se administra in vitro a fibroblastos de rata y células COS, y a ratones in vivo . [21] [64] [65] PF-4800567 , también desarrollado por Pfizer, es un inhibidor específico de CK1ε. Sin embargo, su capacidad para alargar los ritmos circadianos es más débil que la de PF-670462 tanto en los modelos de fibroblastos de rata in vitro como en los modelos de ratones in vivo . [65] Los mecanismos de inhibición de PF-670462 y PF-4800567 también difieren entre las dos moléculas. [8] PF-670462 mantiene CK1ε/δ con el motivo DFG hacia adentro, mientras que PF-4800567 interactúa hidrofóbicamente con CK1ε/δ para girar el motivo DFG hacia afuera, lo que indica una quinasa tipo II. [8]
IC261 es un inhibidor que se dirige al sitio de unión de ATP de CK1δ y CK1ε. [21] [66] [57] De manera similar, se ha demostrado que alarga el período circadiano en fibroblastos de rata , [66] y se lo ha implicado en terapias de tratamiento del cáncer para cánceres pancreáticos y neuroblastómicos. [67] [57]
Se ha demostrado que otros inhibidores de CK1, como D4476 y análogos de pirazolopiridina , que tienen como objetivo CK1δ, tienen capacidades terapéuticas, pero sus efectos beneficiosos no están bien estudiados y pueden provenir de otros objetivos celulares. [57]
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