La carboxipeptidasa A generalmente se refiere a la exopeptidasa pancreática que hidroliza los enlaces peptídicos de los residuos C-terminales con cadenas laterales aromáticas o alifáticas . La mayoría de los científicos en el campo ahora se refieren a esta enzima como CPA1 , y a una carboxipeptidasa pancreática relacionada como CPA2 .
Además, existen otras cuatro enzimas de mamíferos denominadas CPA-3 a CPA-6, y ninguna de ellas se expresa en el páncreas. En cambio, estas otras enzimas similares a CPA tienen funciones diversas.
CPA-1 y CPA-2 (y, se supone, todos los demás CPA) emplean un ion zinc dentro de la proteína para la hidrólisis del enlace peptídico en el extremo C-terminal de un residuo de aminoácido. La pérdida de zinc conduce a una pérdida de actividad, que puede ser reemplazada fácilmente por zinc y también por algunos otros metales divalentes ( cobalto , níquel ). La carboxipeptidasa A se produce en el páncreas y es crucial para muchos procesos en el cuerpo humano, incluidos la digestión, la modificación postraduccional de proteínas, la coagulación sanguínea y la reproducción.
Este amplio alcance de funcionalidad de una sola proteína la convierte en el modelo ideal para la investigación de otras proteasas de zinc de estructura desconocida. Investigaciones biomédicas recientes sobre colagenasa, encefalinasa y enzima convertidora de angiotensina utilizaron carboxipeptidasa A para la síntesis de inhibidores y pruebas cinéticas. Por ejemplo, un medicamento que trata la presión arterial alta, Captopril, fue diseñado basándose en un inhibidor de la carboxipeptidasa A. La carboxipeptidasa A y la enzima objetivo de Captopril, la enzima convertidora de angiotensina, tienen estructuras muy similares, ya que ambas contienen un ion zinc dentro del sitio activo. Esto permitió utilizar un potente inhibidor de la carboxipeptidasa A para inhibir la enzima y, así, reducir la presión arterial a través del sistema renina-angiotensina-aldosterona. [1]
La carboxipeptidasa A (CPA) contiene un centro metálico de zinc (Zn 2+ ) en una geometría tetraédrica con residuos de aminoácidos muy próximos alrededor del zinc para facilitar la catálisis y la unión. De los 307 aminoácidos unidos en una cadena peptídica, los siguientes residuos de aminoácidos son importantes para la catálisis y la unión; Glu-270, Arg-71, Arg-127, Asn-144, Arg-145 y Tyr-248. La Figura 1 ilustra el sitio activo del complejo tetraédrico de zinc con los residuos de aminoácidos importantes que rodean el complejo. [2]
El zinc metálico es un fuerte catalizador electrófilo de ácido de Lewis que estabiliza una molécula de agua coordinada y estabiliza los intermedios negativos que se producen durante la reacción hidrolítica. La estabilización tanto de la molécula de agua coordinada como de los intermedios negativos está asistida por residuos polares en el sitio activo que están muy cerca para facilitar los enlaces de hidrógeno. [2]
El sitio activo se puede caracterizar en dos subsitios denominados S1 ' y S1 . El subsitio S 1 ' es la bolsa hidrofóbica de la enzima, y Tyr-248 actúa para "tapar" la bolsa hidrofóbica después de que se une el sustrato o el inhibidor (SITE). [2] El enlace de hidrógeno del grupo hidroxilo en Tyr-248 facilita esta conformación debido a la interacción con los carboxilatos terminales de los sustratos que se unen. Se requiere un movimiento sustancial para esta enzima y el modelo de ajuste inducido explica cómo se produce esta interacción.
Una tríada de residuos interactúa con el carboxilato C-terminal a través de enlaces de hidrógeno:
Clasificada como metaloexopeptidasa, la carboxipeptidasa A consta de una única cadena polipeptídica unida a un ion zinc. Este ion metálico característico se encuentra dentro del sitio activo de la enzima, junto con cinco residuos de aminoácidos que participan en la unión del sustrato: Arg-71, Arg-127, Asn-144, Arg-145, Tyr-248 y Glu- 270. Los estudios cristalográficos de rayos X han revelado cinco subsitios en la proteína. Estos sitios alostéricos participan en la creación de la especificidad ligando-enzima que se observa en la mayoría de las enzimas bioactivas. Uno de estos subsitios induce un cambio conformacional en Tyr-248 tras la unión de una molécula de sustrato en el sitio activo primario. El hidroxilo fenólico de tirosina forma un enlace de hidrógeno con el carboxilato terminal del ligando. Además, se forma un segundo enlace de hidrógeno entre la tirosina y un enlace peptídico de sustratos peptídicos más largos. Estos cambios hacen que el vínculo entre la enzima y el ligando, ya sea sustrato o inhibidor, sea mucho más fuerte. Esta propiedad de la carboxipeptidasa A condujo a la primera cláusula de la hipótesis del “ajuste inducido” de Daniel E. Koshland, Jr.
El subsitio S 1 es donde se produce la catálisis en CPA, y el ion zinc está coordinado por los residuos de las enzimas Glu-72, His-69 e His-196. Existe un plano que biseca el surco del sitio activo donde los residuos Glu-270 y Arg-127 están en lados opuestos del complejo acoplado zinc-agua. El zinc es rico en electrones debido a los ligandos de glutamina que coordinan el zinc porque antes de que el sustrato se una, el Glu-72 coordina el bidentado pero cambia a monodentado después de que el sustrato se une. Como resultado, el zinc metálico no puede desprotonar la molécula de agua coordinada para formar un nucleófilo hidroxilo. [2]
Glu-270 y Arg-127 desempeñan un papel importante en la catálisis que se muestra en la Figura 2. Arg-127 actúa para estabilizar el carbonilo del sustrato que está unido al grupo amino de la fenilalanina. Simultáneamente, la molécula de agua coordinada con zinc es desprotonada por Glu-270 e interactúa con el carbonilo estabilizado por Arg-127. Esto crea un intermedio, como se muestra en la Figura 2, donde el oxígeno cargado negativamente se coordina con el zinc y, a través de interacciones electrostáticas desfavorables entre Glu-270 y el producto ionizado, se facilita la liberación del producto al final de la catálisis. [2]
En estudios computacionales recientes, el mecanismo de catálisis es similar, pero la diferencia en el mecanismo es que la molécula de agua desprotonada se une al carbono del carbonilo, mientras que la Figura 2 muestra que el grupo hidroxilo permanece coordinado con el zinc. Luego se produce la proteólisis y la molécula de agua se introduce nuevamente en el sitio activo para coordinarse con el zinc. [3]
Se han realizado varios estudios que exploran los detalles del enlace entre la carboxipeptidasa A y el sustrato y cómo esto afecta la tasa de hidrólisis. En 1934, se descubrió por primera vez mediante experimentos cinéticos que, para que el sustrato se una, el péptido que se va a hidrolizar debe estar adyacente a un grupo hidroxilo libre terminal. Además, la velocidad de hidrólisis puede mejorarse si el residuo C-terminal es alifático o aromático ramificado. Sin embargo, si el sustrato es un dipéptido con un grupo amino libre, sufre hidrólisis lentamente; esto, sin embargo, puede evitarse si el grupo amino se bloquea mediante N-acilación. [4]
Está bastante claro que la estructura de la enzima, concretamente el sitio activo, es muy importante para comprender el mecanismo de reacción. Por este motivo, Rees y sus colegas estudiaron el complejo enzima-ligando para obtener una respuesta clara sobre el papel del ion zinc. Estos estudios encontraron que, en la enzima libre, el número de coordinación del zinc es cinco; el centro metálico está coordinado con dos nitrógenos imidazol Nδ1, los dos oxígenos carboxilato del glutamato-72 y una molécula de agua para formar un tetraédrico distorsionado. Sin embargo, una vez que el ligando se une al sitio activo de la carboxipeptidasa A, este número de coordinación puede variar de cinco a seis. Cuando se une al dipéptido glicil-L-tirosina, el nitrógeno amino del dipéptido y el oxígeno carbonílico reemplazaron al ligando agua. Esto produciría un número de coordinación de seis para el zinc en el complejo carboxipeptidasa A-dipéptido glicil-L-tirosina. Los mapas de densidad electrónica dieron evidencia de que el aminonitrógeno ocupa una segunda posición cerca del glutamato-270. La cercanía de estos dos residuos daría como resultado un impedimento estérico que impediría que el ligando agua se coordine con el zinc. Esto daría como resultado un número de coordinación de cinco. Los datos para ambos son sustanciales, lo que indica que ambas situaciones ocurren de forma natural. [5]
Hay dos mecanismos propuestos para la función catalítica de la carboxipeptidasa A. El primero es una vía nucleofílica que involucra un intermedio de enzima acilo covalente que contiene la base del sitio activo Glu-270. La evidencia sobre este intermediario anhídrido es mixta; Suh y sus colegas aislaron lo que se supone que es el intermedio acilo. Sin embargo, la confirmación de la enzima acilo se realizó sin experimentos de captura, lo que debilita las conclusiones. [1]
El segundo mecanismo propuesto es una vía de agua promovida. Este mecanismo implica el ataque de una molécula de agua al enlace peptídico escindible del sustrato. Este proceso es promovido por el ion zinc y asistido por el residuo Glu-270. [1]
