La fragmentación apoptótica del ADN es una característica clave de la apoptosis , un tipo de muerte celular programada . La apoptosis se caracteriza por la activación de endonucleasas endógenas , particularmente la ADNasa activada por caspasa-3 (CAD), [1] con la posterior escisión del ADN nuclear en fragmentos internucleosomales de aproximadamente 180 pares de bases (pb) y múltiplos de los mismos (360, 540, etc. ). La fragmentación apoptótica del ADN se utiliza como marcador de apoptosis y para la identificación de células apoptóticas, ya sea mediante el ensayo de escalera de ADN , [2] el ensayo TUNEL , [3] [4] o mediante la detección de células con contenido fraccional de ADN (" células sub G 1 ") en histogramas de frecuencia de contenido de ADN, por ejemplo, como en el ensayo Nicoletti . [5] [6]
La enzima responsable de la fragmentación apoptótica del ADN es la C aspasa- DNasa activada ( CAD) . La CAD normalmente es inhibida por otra proteína, el inhibidor de la ADNasa activada por aspasa (ICAD) . Durante la apoptosis, la caspasa efectora apoptótica, caspasa-3 , escinde ICAD y, por lo tanto, hace que CAD se active. [7]
CAD escinde el ADN en los sitios de enlace internucleosomal entre los nucleosomas , estructuras que contienen proteínas que se encuentran en la cromatina a intervalos de ~180 pb. Esto se debe a que el ADN normalmente está estrechamente envuelto alrededor de las histonas , las proteínas centrales de los nucleosomas. Los sitios enlazadores son las únicas partes de la cadena de ADN que están expuestas y, por tanto, accesibles al CAD.
La degradación del ADN nuclear en unidades nucleosomales es una de las características de la muerte celular apoptótica. Ocurre en respuesta a diversos estímulos apoptóticos en una amplia variedad de tipos de células. La caracterización molecular de este proceso identificó una DNasa específica (CAD, DNasa activada por caspasa) que escinde el ADN cromosómico de manera dependiente de caspasa. CAD se sintetiza con la ayuda de ICAD (inhibidor de CAD), que funciona como un acompañante específico para CAD y se encuentra formando complejo con ICAD en células en proliferación. Cuando se induce a las células a sufrir apoptosis, la caspasa 3 escinde ICAD para disociar el complejo CAD:ICAD, lo que permite que CAD escinda el ADN cromosómico. Las células que carecen de ICAD o que expresan ICAD mutante resistente a caspasa no muestran fragmentación del ADN durante la apoptosis, aunque sí exhiben algunas otras características de la apoptosis y mueren.
Aunque se ha trabajado mucho en el análisis de eventos apoptóticos, hay poca información disponible para vincular el momento de las características morfológicas en la superficie celular y en el núcleo con la degradación bioquímica del ADN en las mismas células. La apoptosis puede iniciarse mediante una multitud de mecanismos diferentes en diferentes tipos de células, y la cinética de estos eventos varía ampliamente, desde sólo unos pocos minutos hasta varios días, dependiendo del sistema celular. La presencia o ausencia de eventos apoptóticos particulares, incluida la fragmentación del ADN, depende de la "ventana de tiempo" en la que se investiga el proceso cinético de la apoptosis. A menudo, esto puede complicar la identificación de células apoptóticas si las poblaciones de células se analizan sólo en un único momento, por ejemplo, después de la inducción de la apoptosis.
El descubrimiento de la fragmentación internucleosomal del ADN genómico en fragmentos oligonucleosomales repetidos regularmente generados por la endonucleasa dependiente de Ca/Mg se acepta como uno de los marcadores bioquímicos de apoptosis (muerte celular programada) mejor caracterizados .
En 1970, Williamson describió que el ADN citoplasmático aislado de células de hígado de ratón después del cultivo se caracterizaba por fragmentos de ADN con un peso molecular múltiplo de 135 kDa . Este hallazgo fue consistente con la hipótesis de que estos fragmentos de ADN eran un producto de degradación específico del ADN nuclear. [8] En 1972, Kerr , Wyllie y Currie acuñaron el término apoptosis y distinguieron este tipo de muerte celular de la necrosis basándose en características morfológicas. [9] En 1973, Hewish y Burgoyne , durante el estudio de la estructura de la subcromatina, encontraron que la cromatina es accesible a la endonucleasa Ca ++ /Mg ++ , dando como resultado la formación de un producto de digestión con una serie regular de peso molecular similar a el descrito previamente por Williamson (1970). [10] En 1974, Williams , Little y Shipley , utilizando células expuestas a tipos muy diferentes de traumatismos, descubrieron que durante la muerte celular, el ADN degradado en "todos los casos tenía un valor modal de entre 10(x6) y 10(x7) Dalton y el metabolismo celular son necesarios para producir la degradación del ADN". Sin embargo, esta observación no indicaba "si el ataque de la incisión en la molécula de ADN fue aleatorio o más bien en un sitio particular, que tiene un significado estructural o funcional". [11] En 1976, Scalka , Matyasova y Cejkova describieron la fragmentación internucleosomal del ADN de cromatina linfoide irradiado in vivo . [12]
Pasaron seis años desde 1972 hasta 1978/1980 hasta el descubrimiento y evaluación de la fragmentación internucleosomal del ADN durante la muerte celular apoptótica como sello distintivo de la apoptosis. Desde 1972 ( Kerr , Wyllie y Currie [9] ), se acepta que la muerte de linfocitos inducida por glucocorticoides es una forma de apoptosis. En 1978, Zakharyan y Pogosyan presentaron un artículo que revelaba que la degradación del ADN inducida por glucocorticoides en el tejido linfoide, el timo y el bazo de rata se producía con un patrón específico que producía fragmentos de ADN que eran electroforéticamente similares a los observados después del tratamiento de la cromatina con nucleasa microcócica, que El patrón de degradación del ADN de escisión internucleosomal indicado se produjo durante la apoptosis. [13] [14] Así, se descubrió el primer vínculo entre la muerte celular programada/apoptosis y la fragmentación internucleosomal del ADN de la cromatina y pronto se convirtió en una característica específica de la apoptosis.
En 1980, Wyllie informó evidencia adicional de un patrón de escisión del ADN internucleosomal como una característica específica de los timocitos tratados con glucocorticoides que experimentan apoptosis. [2] El patrón de escisión del ADN internucleosomal se observó como una característica específica de la apoptosis en 1978/1980 y desde entonces se ha convertido en un sello reconocido de la muerte celular programada. En 1992 Gorczyca et al. [3] y Gavrieli et al. [4] describieron de forma independiente el ensayo de fragmentación del ADN basado en el uso de la desoxinucleotidil transferasa terminal ( TUNEL ), que se convierte en uno de los métodos estándar para detectar e identificar células apoptóticas.
La citometría de flujo se utiliza con mayor frecuencia para detectar la fragmentación del ADN apoptótica. [15] El análisis del contenido de ADN mediante citometría de flujo puede identificar células apoptóticas con ADN fragmentado como células con contenido de ADN fraccional, a menudo llamadas células sub-G 1 . El ensayo de citometría de flujo que utiliza el fluorocromo naranja de acridina muestra que la fragmentación del ADN dentro de las células individuales es discontinua, probablemente reflejando diferentes niveles de restricción en la accesibilidad del ADN a la DNasa, por los niveles supranucleosomales y nucleosomales de la estructura de la cromatina. [16] La presencia de "células sub-G 1 " apoptóticas también se puede detectar en células prefijadas en etanol , pero no después de la fijación en fijadores reticulantes como el formaldehído . Es posible que las células apoptóticas tardías S y G 2 no se detecten con este enfoque porque su contenido fraccional de ADN puede superponerse con el de las células G 1 no apoptóticas . [17] El tratamiento de las células con detergente, antes o simultáneamente con el fluorocromo de ADN, también revela la fragmentación del ADN en virtud de la presencia de células sub-G 1 o fragmentos de células, tal como lo definen Nicoletti et al. [5]
La fragmentación apoptótica del ADN también puede detectarse mediante el ensayo TUNEL . El ensayo TUNEL basado en fluorocromo, aplicable para citometría de flujo , correlaciona la detección de roturas de cadenas de ADN con el contenido de ADN celular y, por tanto, con la posición de la fase del ciclo celular . El ensayo TUNEL de marcado con avidina-peroxidasa es aplicable para microscopía de absorción de luz. Muchos kits relacionados con TUNEL están disponibles comercialmente. La fragmentación apoptótica del ADN también se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para demostrar un patrón en "escalera" a intervalos de ~180 BP . [1] La necrosis , por otro lado, generalmente se caracteriza por una fragmentación aleatoria del ADN que forma una "mancha" en los geles de agarosa.
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