El análisis del ciclo celular mediante la medición del contenido de ADN es un método que emplea con mayor frecuencia la citometría de flujo para distinguir las células en diferentes fases del ciclo celular . Antes del análisis, las células suelen permeabilizarse y tratarse con un colorante fluorescente que tiñe el ADN cuantitativamente, como el yoduro de propidio (PI) o el 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). La intensidad de la fluorescencia de las células teñidas se correlaciona con la cantidad de ADN que contienen. A medida que el contenido de ADN se duplica durante la fase S , el contenido de ADN (y, por lo tanto, la intensidad de la fluorescencia) de las células en la fase G 0 y la fase G 1 (antes de S), en la fase S y en la fase G 2 y la fase M (después de S) identifica la posición de la fase del ciclo celular en las fases principales (fase G 0 /G 1 frente a fase S frente a fase G 2 /M) del ciclo celular. El contenido de ADN celular de células individuales a menudo se representa como su histograma de frecuencia para proporcionar información sobre la frecuencia relativa (porcentaje) de células en las fases principales del ciclo celular.
Las anomalías del ciclo celular que se revelan en el histograma de frecuencia del contenido de ADN se observan a menudo después de diferentes tipos de daño celular, por ejemplo, un daño del ADN que interrumpe la progresión del ciclo celular en ciertos puntos de control . Tal detención de la progresión del ciclo celular puede conducir a una reparación eficaz del ADN, que puede prevenir la transformación de una célula normal en una célula cancerosa ( carcinogénesis ), o a la muerte celular, a menudo por el modo de apoptosis . Una detención de células en G 0 o G 1 se ve a menudo como resultado de la falta de nutrientes (factores de crecimiento), por ejemplo, después de la privación de suero . El análisis del ciclo celular fue descrito por primera vez en 1969 en el Laboratorio Científico de Los Álamos por un grupo de la Universidad de California utilizando la técnica de tinción de Feulgen . [1] El primer protocolo para el análisis del ciclo celular utilizando tinción con yoduro de propidio fue presentado en 1975 por Awtar Krishan de la Facultad de Medicina de Harvard y todavía se cita ampliamente en la actualidad. [2]
El análisis multiparamétrico del ciclo celular incluye, además de la medición del contenido de ADN celular, otros constituyentes/características relacionados con el ciclo celular. La medición concurrente del contenido de ADN y ARN celular, o la susceptibilidad del ADN a la desnaturalización a bajo pH utilizando el colorante metacromático naranja de acridina , revela los compartimentos del ciclo celular G 1Q , G 1A y G 1B y también permite discriminar entre células S, G 2 y mitóticas. [3] Las células en G 1Q están inactivas, retiradas temporalmente del ciclo celular (también identificables como G 0 ), las G 1A están en la fase de crecimiento mientras que las G 1B son las células justo antes de entrar en S, con su crecimiento (contenido de ARN y proteína, tamaño) similar al de las células que inician la replicación del ADN. Compartimentos similares del ciclo celular también se reconocen mediante análisis multiparamétrico que incluye la medición de la expresión de ciclina D1 , ciclina E , ciclina A y ciclina B1 , cada una en relación con el contenido de ADN [4] La medición concurrente del contenido de ADN y de la incorporación del precursor de ADN 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) por citometría de flujo es un ensayo especialmente útil, que se ha utilizado ampliamente en el análisis del ciclo celular in vitro e in vivo. [5] Sin embargo, la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), el precursor cuya detección ofrece ciertas ventajas sobre BrdU, se ha convertido ahora en la metodología preferida para detectar células de replicación de ADN (fase S). [6]
A menos que la tinción se realice con Hoechst 33342 , el primer paso en la preparación de las células para el análisis del ciclo celular es la permeabilización de las membranas plasmáticas de las células . Esto generalmente se hace incubándolas en una solución tampón que contenga un detergente suave [7] como Triton X-100 o NP-40 , o fijándolas en etanol . La mayoría de los colorantes fluorescentes de ADN (una de las excepciones es Hoechst 33342 ) no son permeables a la membrana plasmática, es decir, no pueden atravesar una membrana celular intacta. Por lo tanto, la permeabilización es crucial para el éxito del siguiente paso, la tinción de las células.
Antes (o durante el paso de tinción) las células a menudo se tratan con ARNasa A para eliminar los ARN . Esto es importante porque ciertos colorantes que tiñen el ADN también tiñen el ARN, creando así artefactos que distorsionarían los resultados. Una excepción es el fluorocromo metacromático naranja de acridina , que bajo el protocolo de tinción específico puede teñir diferencialmente tanto el ARN (generando luminiscencia roja) como el ADN (fluorescencia verde), o en otro protocolo, después de la eliminación del ARN y la desnaturalización parcial del ADN, para teñir diferencialmente el ADN bicatenario (fluorescencia verde) frente al ADN monocatenario (luminiscencia roja) [3] . Aparte del yoduro de propidio y el naranja de acridina, los colorantes cuantificables que se utilizan con frecuencia incluyen (pero no se limitan a) DRAQ5, 7-aminoactinomicina D , DAPI y Hoechst 33342 .
Dado que las células, y especialmente las células fijadas, tienden a pegarse entre sí, los agregados celulares deben excluirse del análisis mediante un proceso llamado discriminación de dobletes . Esto es importante porque un doblete de dos células G 0 /G 1 tiene el mismo contenido total de ADN y, por lo tanto, la misma intensidad de fluorescencia que una sola célula G 2 /M. [8] [9] A menos que se reconozcan como tales, los dobletes G 0 /G 1 contribuirían a la identificación y el recuento de células G 2 /M con resultados positivos falsos .
El ensayo Nicoletti , llamado así por su inventor, el médico italiano Ildo Nicoletti, es una forma modificada de análisis del ciclo celular. Se utiliza para detectar y cuantificar la apoptosis , una forma de muerte celular programada , mediante el análisis de células con un contenido de ADN inferior a 2n ("células sub-G 0 /G 1 "). Estas células suelen ser el resultado de la fragmentación del ADN apoptótico : durante la apoptosis, el ADN es degradado por endonucleasas celulares . Por lo tanto, los núcleos de las células apoptóticas contienen menos ADN que los núcleos de las células G 0 /G 1 sanas , lo que da como resultado un pico sub-G 0 /G 1 en el histograma de fluorescencia que se puede utilizar para determinar la cantidad relativa de células apoptóticas en una muestra. Este método fue desarrollado y descrito por primera vez en 1991 por Nicoletti y sus colaboradores en la Facultad de Medicina de la Universidad de Perugia . [10] En 2006 se publicó un protocolo optimizado desarrollado por dos de los autores de la publicación original. [11] Los objetos medidos dentro del pico sub-G 0 /G 1 , con un contenido de ADN menor al 5 % del del pico G 0 G 1 , con toda probabilidad son cuerpos apoptóticos y, por lo tanto, no representan células apoptóticas individuales [12]
