Una rata knockout es una rata modificada genéticamente con un solo gen desactivado a través de una mutación dirigida ( captura de genes ) que se utiliza para la investigación académica y farmacéutica . Las ratas knockout pueden imitar enfermedades humanas y son herramientas importantes para estudiar la función genética ( genómica funcional ) y para el descubrimiento y desarrollo de fármacos. La producción de ratas knockout no fue económica ni técnicamente factible hasta 2008. [1] [2] [3] [4]
Tecnología desarrollada a través del financiamiento de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y el trabajo realizado por los miembros de laEl Consorcio de Ratas Knock Out (KORC) ha desarrollado métodos rentables para crear ratas knock out. La importancia de desarrollar la rata como una herramienta más versátil para la investigación en salud humana se evidencia en la inversión de 120 millones de dólares realizada por el NIH a través del proyectoConsorcio del Proyecto de Secuenciación del Genoma de la Rata , que dio como resultado el borrador de la secuencia de una cepa de laboratorio de la rata parda o noruega ( Rattus norvegicus ). [5] Los desarrollos adicionales con la tecnología de nucleasa de dedo de zinc en 2009 condujeron a la primera rata knockout con mutaciones dirigidas transmitidas por la línea germinal. [6] Los modelos de enfermedades de ratas knockout para Parkinson , Alzheimer , hipertensión y diabetes que utilizan la tecnología de nucleasa de dedo de zinc están siendo comercializados por SAGE Labs. [7] [8]
Los ratones, las ratas y los humanos comparten casi el 1% de sus genes [5] [9] [10], lo que convierte a los roedores en buenos organismos modelo para estudiar la función de los genes humanos. Tanto los ratones como las ratas son relativamente pequeños, fáciles de manipular, tienen un tiempo generacional corto y son genéticamente endogámicos. Si bien los ratones han demostrado ser un modelo útil para los roedores y se han desarrollado técnicas para la alteración rutinaria de sus genes, en muchas circunstancias las ratas se consideran un animal de laboratorio superior para estudiar y modelar las enfermedades humanas.
Las ratas son fisiológicamente más similares a los humanos que los ratones. Por ejemplo, las ratas tienen una frecuencia cardíaca más similar a la de los humanos, mientras que los ratones tienen una frecuencia cardíaca cinco a diez veces más rápida. Se cree ampliamente que la rata es un mejor modelo que el ratón para las enfermedades cardiovasculares humanas , la diabetes, la artritis y muchos trastornos autoinmunes , neurológicos , conductuales y de adicción. [11] Además, los modelos de rata son superiores a los modelos de ratón para probar la farmacodinámica y la toxicidad de posibles compuestos terapéuticos, en parte porque el número y el tipo de muchas de sus enzimas desintoxicantes son muy similares a los de los humanos. [12] Su mayor tamaño hace que las ratas sean más propicias para el estudio mediante instrumentación y también facilita la manipulación, como la toma de muestras de sangre, la conducción nerviosa y la realización de cirugías.
Existen técnicas de manipulación genética en el ratón, que se utiliza habitualmente para modelar enfermedades humanas. Aunque existen knockouts publicados para aproximadamente el 60% [13] de los genes del ratón, una gran mayoría de enfermedades humanas comunes no tienen un modelo de ratón knockout . Los modelos de rata knockout son una alternativa a los ratones que pueden permitir la creación de nuevas disrupciones genéticas que no están disponibles en el ratón. Los modelos de rata knockout también pueden complementar los modelos de ratón transgénico existentes. La comparación de mutantes de ratón y rata puede facilitar la distinción entre fenotipos específicos de roedores y fenotipos generales de mamíferos .
Los modelos de rata se han utilizado para avanzar en muchas áreas de investigación médica, incluyendo enfermedades cardiovasculares, trastornos psiquiátricos (estudios de intervención conductual y adicción), regeneración neuronal , diabetes, trasplantes , trastornos autoinmunes ( artritis reumatoide ), cáncer y curación de heridas y huesos. Si bien la finalización de la secuencia del genoma de la rata proporciona información muy clave, la forma en que estas enfermedades se relacionan con la función genética requiere un método eficiente para crear modelos de rata knockout en los que se manipulen secuencias genómicas específicas. La mayoría de las técnicas de manipulación genética, incluyendo la mutagénesis aleatoria con una trampa genética (basada en retrovirus y no basada en retrovirus), knock-outs/knock-ins de genes y mutaciones condicionales, dependen del cultivo y manipulación de células madre embrionarias (ES). [14] Las células ES de rata se aislaron recientemente y no se ha informado de ninguna demostración de modificación genética en ellas. En consecuencia, muchas técnicas de manipulación genética ampliamente utilizadas en el ratón no son posibles en la rata.
Hasta el desarrollo comercial de la tecnología de ADN móvil en 2007 y la tecnología de nucleasa de dedos de zinc en 2009, solo había dos tecnologías que podían usarse para producir modelos de rata de enfermedades humanas: clonación y mutagénesis química utilizando N-etil-N-nitrosourea ( ENU ). Aunque la clonación por transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) podría usarse teóricamente para crear ratas con mutaciones específicas mutando células somáticas y luego usando estas células para SCNT, este enfoque no se ha utilizado con éxito para crear ratas knockout. Un problema con esta estrategia es que SCNT es extremadamente ineficiente. El primer intento publicado tuvo una tasa de éxito de menos del 1%. [15] Alternativamente, la mutagénesis ENU es una estrategia común de knockout de genes por mutagénesis aleatoria en el ratón que también se puede usar en la rata. La mutagénesis ENU implica el uso de un químico, N-etil-N-nitrosourea (ENU), para crear cambios de una sola base en el genoma. La ENU transfiere su grupo etilo a radicales de oxígeno o nitrógeno en el ADN, lo que da como resultado un emparejamiento incorrecto y una sustitución de pares de bases. Se pueden producir animales mutantes inyectando ENU a un ratón macho y cruzándolo con una hembra de tipo salvaje para producir crías mutantes. La mutagénesis de ENU crea una alta frecuencia de mutaciones aleatorias, con aproximadamente un cambio de par de bases en cualquier gen dado en cada 200-700 gametos. [16] A pesar de su alta mutagenicidad, la penetración física de ENU es limitada y solo se mutan alrededor de 500 genes por cada macho y una cantidad muy pequeña de las mutaciones totales tienen un fenotipo observable. Por lo general, se necesitan crear miles de mutaciones en un solo animal para generar un fenotipo nuevo.
A pesar de las recientes mejoras en la tecnología ENU, [17] [18] [19] el mapeo de las mutaciones responsables de un fenotipo particular es típicamente difícil y lleva mucho tiempo. Las mutaciones neutrales deben separarse de las mutaciones causales, mediante una crianza extensiva. Los métodos de ENU y clonación son simplemente ineficientes para crear y mapear genes knockout en ratas para la creación de nuevos modelos de enfermedades humanas. Hasta 2007, el proyecto de mutagénesis de ENU en ratas más grande hasta la fecha dirigido por el Colegio Médico de Wisconsin fue capaz de producir sólo 9 líneas de ratas knockout en un período de cinco años a un costo promedio de $200,000 por línea knockout. Aunque algunas compañías todavía están aplicando esta estrategia, el Colegio Médico de Wisconsin ha cambiado a un método más eficiente y comercialmente viable que utiliza ADN móvil y tecnología CompoZr ZFN.
Las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y las nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN) son proteínas de unión al ADN diseñadas que facilitan la edición dirigida del genoma mediante la creación de roturas de doble cadena en el ADN en lugares especificados por el usuario. Las roturas de doble cadena son importantes para la mutagénesis específica del sitio, ya que estimulan los procesos naturales de reparación del ADN de la célula, es decir, la recombinación homóloga y la unión de extremos no homólogos. Cuando la célula utiliza la vía de unión de extremos no homólogos para reparar la rotura de doble cadena, la inexactitud inherente de la reparación a menudo genera mutaciones dirigidas con precisión. Esto da como resultado embriones con inactivación génica dirigida. [6] [20] Las técnicas de microinyección estándar permiten que esta tecnología produzca ratas inactivadas en 4 a 6 meses. Una ventaja importante de la inactivación génica mediada por ZFN y TALEN en relación con el uso de ADN móvil es que un gen en particular puede ser el objetivo único y específico para la inactivación. Por el contrario, los knockouts realizados mediante tecnología de ADN móvil son aleatorios y, por lo tanto, es poco probable que tengan como objetivo el gen de interés.
La tecnología de ADN móvil (genes saltarines) utiliza retrotransposones y transposones para la producción de modelos de ratas knockout. Esta tecnología de plataforma cumple con todos los criterios para un enfoque exitoso de knockout genético en mamíferos al permitir la mutagénesis aleatoria directamente en las células germinales ( espermatozoides y ovocitos ) de organismos modelo mamíferos, incluidas las ratas. Usando esta tecnología, los genes se alteran completamente y de manera estable, se eliminan con una alta frecuencia y se alteran aleatoriamente en todo el genoma. La ubicación genómica de las mutaciones se puede mapear fácilmente, creando una biblioteca de ratas knockout para uso posterior. Una vez que se crean las mutaciones knockout aleatorias, se pueden crear mutaciones más refinadas, como las mutaciones condicionales, mediante la cría de líneas knockout con líneas de ratas que expresan la recombinasa CRE de una manera específica del tejido. Los knock-ins se pueden producir mediante intercambio de casetes mediado por recombinación.
Los transposones de ADN de piggyBac (PB) se movilizan a través de un mecanismo de "cortar y pegar" mediante el cual una enzima transposasa (PB transposasa), codificada por el propio transposón, escinde y reintegra el transposón en otros sitios dentro del genoma. La transposasa PB reconoce específicamente las repeticiones terminales invertidas (ITR) de PB que flanquean el transposón; se une a estas secuencias y cataliza la escisión del transposón. PB luego se integra en los sitios TTAA [21] en todo el genoma, de una manera relativamente aleatoria. Para la creación de mutaciones de trampa génica (o adaptadas para generar animales transgénicos), la transposasa se suministra en trans en un plásmido y se cotransfecta con un plásmido que contiene un transposón donante, un transposón recombinante que comprende una trampa génica flanqueada por los sitios de unión para la transposasa (ITR). La transposasa catalizará la escisión del transposón del plásmido y la posterior integración en el genoma. La integración dentro de una región codificante capturará los elementos necesarios para la expresión de la trampa génica. PB posee varias propiedades ideales: (1) se inserta preferentemente dentro de los genes (entre el 50 y el 67 % de las inserciones afectan a los genes), (2) no muestra saltos locales (cobertura genómica generalizada), (3) no es sensible a la inhibición por sobreproducción en la que los niveles elevados de la transposasa causan una disminución de la transposición, y 4) se escinde limpiamente de un sitio donante, sin dejar "huella", a diferencia de La Bella Durmiente. [22] [23]
El transposón Sleeping Beauty (SB) es un derivado de la superfamilia Tc1/mariner de transposones de ADN que prevalece entre los genomas de vertebrados e invertebrados. Sin embargo, los transposones de ADN endógenos de esta familia son completamente inactivos en los genomas de vertebrados. Un transposón Tc1/mariner activo, sintetizado a partir de la alineación de transposones inactivos de la subfamilia de elementos de los salmónidos, fue “despertado” para formar el transposón llamado Sleeping Beauty. [24] SB, al igual que otros transposones de ADN, se moviliza a sí mismo a través de un mecanismo de cortar y pegar mediante el cual una enzima transposasa, codificada por el propio transposón, escinde y reintegra el transposón en otros sitios dentro del genoma. La proteína SB de 340 aminoácidos reconoce las repeticiones terminales invertidas (ITR) que flanquean el transposón; se une a estas secuencias y cataliza la escisión del transposón. Luego, el SB se integra en sitios aleatorios dentro del genoma, aunque algunos estudios informan preferencias muy leves por las unidades transcripcionales. [25] [26] También existe un requisito simple de un dinucleótido TA en el sitio objetivo, como todos los transposones Tc1/mariner. [27]
El transposón SB es una herramienta poderosa para la mutagénesis insercional en muchas especies de vertebrados. Recientemente ha demostrado una utilidad especial para la mutagénesis de la línea germinal tanto en ratones como en ratas. [28] [29] [30] [ 31] [32] [33] [34] Existen varias ventajas que hacen que SB sea un mutágeno altamente atractivo orientado al descubrimiento de genes: 1) tiene poco sesgo para insertarse dentro de regiones genómicas particulares o dentro de secuencias de reconocimiento específicas, 2) las inserciones de novo del transposón proporcionan un marcador de secuencia "etiquetado" para la identificación rápida de la mutación específica mediante métodos simples de clonación por PCR, 3) la mutagénesis insercional de SB in vivo permite generar múltiples mutaciones de manera rápida y sencilla en un solo animal y en un solo tejido, como un pólipo adenomatoso.
Los transposones y retrotransposones son herramientas valiosas para el descubrimiento imparcial de genes como fragmentos móviles de ADN utilizados para la disrupción de genes. Los retrotransposones, como los LINE (elementos nucleares intercalados largos), se movilizan a través de un mecanismo de "copiar y pegar" y son abundantes en muchas especies eucariotas. Varios retrotransposones L1 han permanecido activos en ratones y humanos. Los L1 contienen un pequeño promotor interno dentro de una región no traducida 5' para impulsar la expresión, dos marcos de lectura abiertos (ORF) y una región no traducida 3' que contiene secuencias para la poliadenilación. Los dos ORF codifican proteínas necesarias para la retrotransposición autónoma; ORF1 codifica una proteína de unión al ARN , mientras que ORF2 codifica una proteína que contiene actividad de endonucleasa (EN) y transcriptasa inversa (RT), que cortan un sitio en el ADN y luego producen una copia a través de RT. Estas proteínas exhiben una especificidad abrumadora para unirse y actuar sobre la transcripción que las codifica, lo que permite la movilización casi exclusiva del ARN L1 parental. Utilizando la actividad RT de la proteína ORF2, el ARN L1 transcrito se copia en ADN mediante un proceso denominado transcripción inversa con cebado por diana (TPRT), [35] y se integra en el genoma. La integración se produce con poco sesgo para cualquier región genómica en particular, lo que requiere una secuencia de consenso simple, 5'TTTT'A-3' (junto con variaciones menores de esta secuencia). Las secuencias L1 integradas a menudo se truncan en el extremo 5', con un tamaño total promedio de 1 Kb, y muchas contienen solo secuencias terminales 3'.
La naturaleza de la retrotransposición confiere a la L1 algunas ventajas únicas; los retrotransposones L1 tienen un suministro esencialmente ilimitado del mutágeno de inserción, ya que se transcribe continuamente a partir de un promotor, lo que sería útil para aplicaciones en las que se necesitan grandes cantidades de mutaciones en una sola célula. Los elementos L1 también demuestran una amplia cobertura genómica, con una distribución en gran medida aleatoria de las inserciones. [36] [37] [38] Las inserciones L1 en sitios genómicos también son irreversibles y, por lo tanto, cualquier evento mutagénico causado por una inserción L1 está "marcado" por las secuencias L1.