Una preparación de plásmido es un método de extracción y purificación de ADN plasmídico , es un paso importante en muchos experimentos de biología molecular y es esencial para el uso exitoso de plásmidos en investigación y biotecnología . [1] [2] Se han desarrollado muchos métodos para purificar el ADN plasmídico de bacterias . [1] [3] Durante el procedimiento de purificación, el ADN plasmídico a menudo se separa de las proteínas contaminantes y del ADN genómico.
Estos métodos implican invariablemente tres pasos: crecimiento del cultivo bacteriano, recolección y lisis de las bacterias y purificación del ADN plasmídico. [4] La purificación de plásmidos es fundamental para la clonación molecular . Un plásmido purificado se puede utilizar para muchas aplicaciones estándar, como secuenciación y transfecciones en células.
Los plásmidos casi siempre se purifican a partir de cultivos de bacterias líquidas , generalmente E. coli , que han sido transformadas y aisladas. [5] [6] Prácticamente todos los vectores plasmídicos de uso común codifican uno o más genes de resistencia a los antibióticos como marcador seleccionable , por ejemplo, un gen que codifica la resistencia a la ampicilina o la kanamicina, lo que permite que las bacterias que se han transformado con éxito se multipliquen sin inhibiciones. [7] [8] [9] Se supone que las bacterias que no han absorbido el vector plasmídico carecen del gen de resistencia y, por lo tanto, solo se espera que crezcan colonias que representen transformaciones exitosas. [5] [9] [10] Las bacterias se cultivan en condiciones favorables.
Existen varios métodos para la lisis celular, incluida la lisis alcalina, la lisis mecánica y la lisis enzimática. [11] [12] [13] [14]
El método más común es la lisis alcalina, que implica el uso de una alta concentración de una solución básica, como hidróxido de sodio , para lisar las células bacterianas. [15] [16] [17] Cuando las bacterias se lisan en condiciones alcalinas (pH 12,0–12,5), tanto el ADN cromosómico como las proteínas se desnaturalizan; Sin embargo, el ADN plasmídico permanece estable. [16] [17] Algunos científicos reducen la concentración de NaOH utilizada a 0,1 M para reducir la aparición de ssDNA . Después de añadir un tampón de neutralización que contiene acetato para reducir el pH a aproximadamente 7, el ADN cromosómico y las proteínas, grandes y menos superenrollados, forman grandes complejos y precipitan; pero los pequeños plásmidos de ADN bacteriano permanecen en solución. [17] [14]
La lisis mecánica implica el uso de fuerza física, como trituración o sonicación , para descomponer las células bacterianas y liberar el ADN plásmido. Hay varios métodos diferentes de lisis mecánica que se pueden utilizar, incluida la prensa francesa , el batido de perlas y la ultrasonicación . [11] [12] [13] [14]
La lisis enzimática, también llamada lisis de lisozima , implica el uso de enzimas para digerir la pared celular y liberar el ADN plásmido. [11] La enzima más comúnmente utilizada para este propósito es la lisozima, que descompone el peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram-positivas . Generalmente se agrega lisozima al cultivo bacteriano, seguido de calentar y/o agitar el cultivo para liberar el ADN plasmídico. [11] [12] [13] [14]
La preparación de plásmidos se puede dividir en cinco categorías principales según la escala de la preparación: minipreparación, midipreparación, maxipreparación, megapreparación y gigapreparación. La elección de qué método utilizar dependerá de la cantidad de ADN plasmídico necesaria, así como de la aplicación específica para la que se utilizará. [18] [19]
Hay kits disponibles de distintos fabricantes para purificar el ADN plasmídico, que se denominan según el tamaño del cultivo bacteriano y el correspondiente rendimiento del plásmido. En orden creciente son: miniprep, midiprep, maxiprep, megaprep y gigaprep. El rendimiento del ADN plasmídico variará según el número, tipo y tamaño de copias del plásmido, la cepa bacteriana , las condiciones de crecimiento y el kit. [2]
La minipreparación de ADN plasmídico es un aislamiento rápido y a pequeña escala de ADN plasmídico de bacterias . [20] [21] Los métodos de minipreparación comúnmente utilizados incluyen lisis alcalina y kits basados en columnas de giro . [3] [22] Se basa en el método de lisis alcalina . El ADN plasmídico extraído resultante de realizar una minipreparación a menudo se denomina "minipreparación". Los minipreps se utilizan en el proceso de clonación molecular para analizar clones bacterianos . El rendimiento típico de ADN plasmídico de una minipreparación es de 5 a 50 µg, dependiendo de la cepa celular. La minipreparación de un gran número de plásmidos también se puede realizar cómodamente en papel de filtro lisando la célula y eluyendo el plásmido en papel de filtro. [21]
El volumen inicial del cultivo de E. coli es de 15 a 25 ml de caldo de lisogenia (LB) y el rendimiento de ADN esperado es de 100 a 350 µg.
El volumen inicial del cultivo de E. coli es de 100 a 200 ml de LB y el rendimiento de ADN esperado es de 500 a 850 µg.
El volumen inicial del cultivo de E. coli es de 500 ml – 2,5 l de LB y el rendimiento de ADN esperado es de 1,5 a 2,5 mg.
El volumen inicial del cultivo de E. coli es de 2,5 a 5 litros de LB y el rendimiento esperado de ADN es de 7,5 a 10 mg.
Es importante considerar las aplicaciones posteriores del ADN plasmídico al elegir un método de purificación. Por ejemplo, si el plásmido se va a utilizar para transfección o electroporación , es deseable un método de purificación que dé como resultado alta pureza y bajos niveles de endotoxina. De manera similar, si el plásmido se va a utilizar para secuenciación o PCR, es deseable un método de purificación que dé como resultado un alto rendimiento y un mínimo de contaminantes. [2] Sin embargo, existen múltiples métodos de purificación de ácidos nucleicos. [23] [24] [25] Todos funcionan según el principio de generar condiciones en las que solo precipita el ácido nucleico o solo precipitan otras biomoléculas , lo que permite separar el ácido nucleico. [15] [23]
La precipitación con etanol es un método ampliamente utilizado para purificar y concentrar ácidos nucleicos , incluido el ADN plasmídico. [26] El principio básico de este método es que los ácidos nucleicos son insolubles en etanol o isopropanol pero solubles en agua. Por lo tanto, funciona utilizando etanol como antisolvente del ADN, haciendo que precipite de la solución y luego pueda recolectarse mediante centrifugación . La fracción soluble se descarta para eliminar otras biomoléculas. [27]
La purificación de ácidos nucleicos basada en columnas giratorias es un método para purificar ADN, ARN o plásmido de una muestra utilizando un filtro de columna giratoria. [25] El método se basa en el principio de unir selectivamente ácidos nucleicos a una matriz sólida en la columna de centrifugación, mientras que otros contaminantes, como proteínas y sales, se eliminan por lavado. Luego se cambian las condiciones para eluir el ácido nucleico purificado de la columna usando un tampón de elución adecuado. [25]
El principio básico de la extracción con fenol-cloroformo es que el ADN y el ARN son relativamente insolubles en fenol y cloroformo, mientras que otros componentes celulares son relativamente solubles en estos disolventes. La adición de una mezcla de fenol / cloroformo disolverá los contaminantes de proteínas y lípidos, dejando los ácidos nucleicos en la fase acuosa. También desnaturaliza proteínas, como la ADNasa , lo cual es especialmente importante si los plásmidos se van a utilizar para la digestión enzimática . De lo contrario, se pueden producir manchas en la forma de ADN plasmídico restringida enzimáticamente. [24]
En la extracción basada en perlas, la adición de una mezcla que contiene perlas magnéticas comúnmente hechas de iones de hierro se une al ADN plasmídico, separándolos de compuestos no deseados mediante una varilla o soporte magnético. [25] Las perlas unidas al plásmido luego se liberan mediante la eliminación del campo magnético y se extraen en una solución de elución para experimentos posteriores, como transformación o digestión de restricción . Esta forma de miniprep también se puede automatizar, lo que aumenta la comodidad y al mismo tiempo reduce el error mecánico.