La lisis alcalina o extracción alcalina es un método utilizado en biología molecular para aislar ADN plasmídico de bacterias.
Las bacterias que contienen el plásmido de interés se cultivan primero , luego se centrifuga una muestra para concentrar el material celular (incluido el ADN ) en un pellet en el fondo del recipiente que lo contiene. El sobrenadante se descarta y luego el pellet se resuspende en un tampón fisiológico que contiene EDTA . El propósito del EDTA es quelar cationes metálicos divalentes como Mg 2+ y Ca 2+ , que son necesarios para la función de las enzimas degradantes del ADN ( ADNasas ) y también sirven para desestabilizar la estructura de fosfato del ADN y la pared celular. La glucosa en el tampón mantendrá la presión osmótica de la célula para evitar que la célula explote. El Tris en el tampón mantendrá el pH de la célula con 8,0 y la ARNasa eliminará el ARN que interrumpirá el experimento.
Por otra parte, se prepara una solución alcalina fuerte compuesta por el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) y una base fuerte como el hidróxido de sodio (NaOH) y luego se añade. La mezcla resultante se incuba durante unos minutos. Durante este tiempo, el detergente rompe las membranas celulares y permite que el álcali entre en contacto y desnaturalice tanto el ADN cromosómico como el plasmídico. Después de romper la membrana celular con SDS, el contenido celular neutralizará el NaOH; por eso el pH de la lisis baja de 12,8 a 12,3. Por lo tanto, si no hay suficientes células bacterianas, el NaOH adicional funcionará para generar pequeños fragmentos de ADN. Pero se pueden utilizar 0,5 M de L-arginina, que puede proporcionar un pH estable, para reemplazar 0,1 M de hidróxido de sodio. [1]
Finalmente, se añade acetato de potasio . Esto acidifica la solución y permite la renaturalización del ADN plasmídico, pero no del ADN cromosómico, que se precipita fuera de la solución. Otra función del potasio es provocar la precipitación del dodecil sulfato de sodio y, por lo tanto, la eliminación del detergente. Se realiza una centrifugación final y, esta vez, el pellet contiene solo restos y se puede descartar. El sobrenadante que contiene el plásmido se retira con cuidado y se puede purificar aún más o utilizar para análisis, como la electroforesis en gel .
También se utiliza a veces la lisis alcalina para extraer material genético de las plantas. Las células vegetales se someten a una solución fuertemente alcalina que contiene un detergente (normalmente un detergente zwitteriónico o no iónico como el Tween 20 ) y la mezcla se incuba a alta temperatura. Este método no se utiliza con tanta frecuencia debido a la tendencia del hidróxido de sodio a dañar el material genético, reduciendo el tamaño de los fragmentos de ADN.