La inmunonomía es el estudio de la regulación del sistema inmunológico y la respuesta a los patógenos utilizando enfoques de todo el genoma . Con el auge de las tecnologías genómicas y proteómicas , los científicos han podido visualizar redes biológicas e inferir interrelaciones entre genes y/o proteínas; recientemente, estas tecnologías se han utilizado para ayudar a comprender mejor cómo funciona el sistema inmunológico y cómo se regula. Dos tercios del genoma están activos en uno o más tipos de células inmunes y menos del 1% de los genes se expresan de forma única en un tipo determinado de célula. Por lo tanto, es fundamental que los patrones de expresión de estos tipos de células inmunes se descifren en el contexto de una red, y no como un individuo, para que sus roles se caractericen correctamente y se relacionen entre sí. [1] Los defectos del sistema inmunológico, como las enfermedades autoinmunes , la inmunodeficiencia y las neoplasias malignas, pueden beneficiarse de los conocimientos genómicos sobre los procesos patológicos. Por ejemplo, el análisis de la variación sistemática de la expresión genética puede relacionar estos patrones con enfermedades específicas y redes genéticas importantes para las funciones inmunológicas. [2]
Tradicionalmente, los científicos que estudian el sistema inmunológico han tenido que buscar antígenos de forma individual e identificar la secuencia proteica de estos antígenos (“ epítopos ”) que estimularían una respuesta inmunológica. Este procedimiento requería que los antígenos se aislaran de células enteras, se digirieran en fragmentos más pequeños y se probaran contra células T y B para observar las respuestas de estas últimas. Estos enfoques clásicos solo podían visualizar este sistema como una condición estática y requerían una gran cantidad de tiempo y trabajo.
La inmunonomía ha facilitado este enfoque gracias a su capacidad de observar el sistema inmunológico en su conjunto y caracterizarlo como un modelo dinámico. Ha revelado que algunas de las características más distintivas del sistema inmunológico son la movilidad, el recambio y la plasticidad continuos de sus células constituyentes. Además, las tecnologías genómicas actuales, como los microarrays , pueden capturar la expresión génica del sistema inmunológico a lo largo del tiempo y pueden rastrear las interacciones de los microorganismos con las células del sistema inmunológico innato . Los nuevos enfoques proteómicos, incluido el mapeo de epítopos de células T y B , también pueden acelerar el ritmo al que los científicos descubren las relaciones entre anticuerpos y antígenos.
El sistema inmunológico de un huésped responde a la invasión de patógenos mediante un conjunto de respuestas específicas para el patógeno en las que participan muchos "jugadores"; estos incluyen anticuerpos , células T auxiliares , células T citotóxicas y muchos otros. Las células presentadoras de antígeno (APC) son capaces de internalizar patógenos y mostrar un fragmento del antígeno -el epítopo- con complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) en la superficie celular. La respuesta de las células T se inicia cuando las células T reconocen estos epítopos mostrados. Solo se necesitan secuencias de péptidos específicos de algunos antígenos específicos del patógeno para estimular las respuestas de las células T y B; es decir, no es necesaria toda la secuencia del péptido patógeno para iniciar una respuesta inmune. El " inmunoma " de un patógeno se describe por su conjunto de epítopos y se puede definir comparando secuencias del genoma y aplicando herramientas inmunoinformáticas. [3]
Ash Alizadeh et al. fueron algunos de los primeros en reconocer el potencial de los microarreglos de ADNc para definir la expresión génica de las células inmunes. Su análisis investigó la expresión génica de los linfocitos B y T humanos durante la activación celular y/o estimulación con citocinas , un tipo de molécula reguladora de la señalización. Se sabía que muchos de los genes activados en los linfocitos T estimulados estaban involucrados en la transición del ciclo celular G0/G1 o codificaban quimiocinas , moléculas de señalización involucradas en la respuesta inflamatoria. Este equipo también pudo visualizar patrones temporales de expresión génica durante la mitogénesis de las células T. En los párrafos finales de su artículo histórico, estos científicos afirman que "prácticamente todos los aspectos de la investigación inmunológica se beneficiarán del análisis de la expresión génica mediante microarreglos de ADNc" y, por lo tanto, anunciaron el auge de la inmunómica.
Debido a la limitación de los microarrays disponibles y a que el genoma humano no estaba completo en ese momento, este mismo grupo de investigadores se sintió motivado a crear un microarray especializado que se centrara en los genes que se expresaban preferentemente en un tipo de célula determinado o que se sabía que eran funcionalmente importantes en un proceso biológico determinado. Como resultado, Alizadeh y sus colegas diseñaron el microarray de ADNc “Lymphochip”, que contenía 13.000 genes y estaba enriquecido con genes importantes para el sistema inmunológico. [4]
El artículo de 1999 de Iyer et al. fue otro que reveló la importancia de aplicar tecnologías genómicas a la investigación inmunológica. Aunque no tenían la intención de abordar ningún aspecto de la inmunidad al comienzo de su experimento, estos investigadores observaron que los perfiles de expresión de fibroblastos estimulados con suero eran mucho más ricos de lo previsto y sugirieron un papel fisiológico importante para los fibroblastos en la curación de heridas. Los genes inducidos por suero se han asociado con procesos relevantes para la curación de heridas, incluidos genes directamente involucrados en la remodelación del coágulo y la matriz extracelular, así como genes que codifican proteínas señal para la inflamación, el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos y la regeneración del tejido epitelial. Además, uno de los resultados más significativos de este análisis de expresión fue el descubrimiento de más de 200 genes previamente desconocidos cuya expresión se regulaba temporalmente durante la respuesta de los fibroblastos al suero. Estos resultados revelaron la importancia de considerar la respuesta inmunitaria como un programa fisiológico colaborativo y pidieron un estudio más profundo del sistema inmunitario como una red, y no solo como piezas individuales. [5]
En 2006, Moutaftsi et al. demostraron que las herramientas de mapeo de epítopos podían identificar con precisión los epítopos responsables del 95% de la respuesta de las células T murinas al virus vaccinia . A través de su trabajo, estos científicos introdujeron el ámbito interdisciplinario de la informática y la inmunología al tiempo que empleaban datos genómicos, proteómicos e inmunológicos. El sorprendente éxito y la facilidad de este método alentaron a los investigadores tanto a definir el inmunoma de otros patógenos como a medir la amplitud y la superposición de los inmunomas de patógenos que dan lugar a la inmunidad. Además, sugirió otras aplicaciones en las que se podrían utilizar las herramientas de mapeo de epítopos, incluidas la autoinmunidad, el trasplante y la inmunogenicidad . [6]
Se han creado varios tipos de microarrays para observar específicamente la respuesta e interacciones del sistema inmunológico. Los microarrays de anticuerpos utilizan anticuerpos como sondas y antígenos como dianas. Pueden utilizarse para medir directamente las concentraciones de antígeno para las que son específicas las sondas de anticuerpos. Los microarrays de péptidos utilizan péptidos antigénicos como sondas y anticuerpos séricos como dianas. Estos pueden utilizarse para aplicaciones inmunológicas funcionales para la comprensión de enfermedades autoinmunes y alergias, definición de epítopos de células B, estudios de vacunas, ensayos de detección y análisis de especificidad de anticuerpos. Los microarrays MHC son el desarrollo más reciente en arreglos inmunológicos y utilizan complejos péptido-MHC y sus moléculas coestimulantes como sondas y poblaciones de células T como dianas. Las células T unidas se activan y secretan citocinas, que son capturadas por anticuerpos de detección específicos. Este microarray puede mapear epítopos de células T restringidos por MHC. [7]
El Lymphochip es un microarray de ADNc humano especializado enriquecido con genes relacionados con la función inmunológica y creado por Ash Alizadeh en la Universidad de Stanford . Se tomaron 17.853 clones de ADNc de tres fuentes. El primer conjunto de clones se seleccionó si las etiquetas de secuencia expresada (EST) identificadas eran únicas o estaban enriquecidas específicamente en bibliotecas de ADNc linfoide; estas representan aproximadamente el 80 % de los clones de Lymphochip. El segundo conjunto de clones se identificó durante el análisis de microarray de primera generación de respuestas inmunológicas. Finalmente, se utilizaron en el Lymphochip 3183 genes que se sabe o se sospecha que tienen funciones en la función inmunológica, la oncogénesis , la apoptosis , la proliferación celular o que son marcos de lectura abiertos de virus humanos patógenos. Con frecuencia se agregan nuevos genes.
El mapeo de epítopos identifica los sitios de los anticuerpos a los que se unen sus antígenos objetivo. En el pasado, los científicos tenían que aislar antígenos, digerirlos en fragmentos más pequeños y determinar cuáles de estos fragmentos estimulaban las respuestas de las células T y B para definir el epítopo de un anticuerpo. Immunomics aprovecha el poder de la bioinformática y ofrece algoritmos de mapeo que aceleran el descubrimiento de secuencias de epítopos. Estos algoritmos son relevantes para el diseño de vacunas y para caracterizar y modificar las respuestas inmunes en el contexto de la autoinmunidad , la endocrinología , la alergia , el trasplante, el diagnóstico y la ingeniería de proteínas terapéuticas.
Los algoritmos de mapeo de epítopos de células T y B pueden predecir computacionalmente epítopos basados en la secuencia genómica de patógenos, sin conocimiento previo de la estructura o función de una proteína. Se utilizan una serie de pasos para identificar epítopos:
El principio rector de la citometría de flujo es que las células o partículas subcelulares se marcan con sondas fluorescentes que pasan a través de un haz de láser y se clasifican según la intensidad de la fluorescencia emitida por las células contenidas en las gotitas. La tinción de tetrámeros de MHC mediante citometría de flujo identifica y aísla células T específicas en función de la especificidad de unión de sus receptores de superficie celular con complejos de péptidos y MHC marcados con fluorescencia. [9]
ELISPOT es una versión modificada del inmunoensayo ELISA y es un método común para monitorear las respuestas inmunes.
La inmunonomía ha tenido un impacto considerable en la comprensión del sistema inmunológico al descubrir diferencias en los perfiles de expresión genética de los tipos de células, caracterizar la respuesta inmunológica, esclarecer los linajes y las relaciones entre las células inmunológicas y establecer redes de regulación genética. Si bien la siguiente lista de contribuciones no es completa, pretende demostrar la amplia aplicación de la investigación inmunológica y sus poderosas consecuencias para la inmunología.
Los microarrays han descubierto patrones de expresión génica que se correlacionan con la activación inducida por antígenos o la anergia en los linfocitos B. Las vías de anergia de los linfocitos implican la inducción de algunas, pero no todas, las vías de señalización utilizadas durante la activación de los linfocitos. Por ejemplo, las vías de las quinasas NFAT y MAPK/ERK se expresan en líneas celulares anérgicas (o “tolerantes”), mientras que las vías de las quinasas N-terminales NF-kB y c-Jun no lo hacen. De los 300 genes cuya expresión se alteró después de la estimulación con antígenos de las células B vírgenes, solo 8 de estos genes se regularon en las células B tolerantes. La comprensión de estas vías de “tolerancia” tiene implicaciones importantes para el diseño de fármacos inmunosupresores. Estas firmas de expresión génica de las células B tolerantes podrían utilizarse durante los análisis de fármacos para investigar compuestos que imiten los efectos funcionales de la tolerancia natural. [10]
Los perfiles de expresión génica durante la diferenciación de linfocitos humanos han seguido a las células B maduras e ingenuas desde su estado de reposo a través de las reacciones del centro germinal hasta la diferenciación terminal. Estos estudios han demostrado que las células B del centro germinal representan una etapa distinta en la diferenciación porque el perfil de expresión génica es diferente de las células B periféricas activadas. Aunque ningún sistema de cultivo in vitro ha sido capaz de inducir a las células B periféricas en reposo a adoptar un fenotipo de centro germinal completo, estos perfiles de expresión génica se pueden utilizar para medir el éxito de los cultivos in vitro en la imitación del estado del centro germinal a medida que se desarrollan. [11]
Aproximadamente 9 de cada 10 cánceres linfoides humanos derivan de células B. Distintos patrones de expresión en todo el sistema inmunitario en un gran número de linfomas difusos de células grandes (DLCL, por sus siglas en inglés), la forma más común de linfoma no Hodgkin, han identificado al menos dos subtipos diferentes en lo que anteriormente se creía que era una sola enfermedad. Un subconjunto de estos DLCL muestra un patrón de expresión génica similar al de las células B del centro germinal normales e implica que la célula tumoral se originó a partir de una célula B del centro germinal. Otros estudios de neoplasias malignas de células B muestran que los linfomas foliculares comparten características de expresión con las células B del centro germinal, mientras que las células de leucemia linfocítica crónica se asemejan a los linfocitos de sangre periférica en reposo. Además, la heterogeneidad en cada una de estas líneas celulares también sugiere que existen diferentes subtipos dentro de cada tipo de linfoma, tal como se ha demostrado en el DLCL. Este conocimiento se puede utilizar para orientar a los pacientes hacia la terapia más adecuada. [12]
Los microarrays han analizado las respuestas globales de los macrófagos a diferentes microorganismos y han confirmado que estas respuestas sostienen y controlan los procesos inflamatorios, y también matan a los microorganismos. Estos estudios independientes han podido describir mejor cómo los macrófagos organizan ataques contra diferentes microorganismos. Se observó una “respuesta transcripcional central” que induce 132 genes y reprime 59 genes. Los genes inducidos incluyen quimiocinas y citocinas proinflamatorias, y sus respectivos receptores. También se observó una “respuesta específica del patógeno”. [13]
Las células dendríticas (CD) ayudan a los macrófagos a mantener los procesos inflamatorios y participar en la respuesta del sistema inmunológico innato , pero también pueden preparar la inmunidad adaptativa . Los análisis de expresión genética han demostrado que las CD pueden "realizar múltiples tareas" al segregar temporalmente sus diferentes funciones. Poco después de reconocer un agente infeccioso, las CD inmaduras pasan a un estado de activación temprana a través de una respuesta central caracterizada por una rápida regulación negativa de los genes involucrados en el reconocimiento de patógenos y la fagocitosis , la regulación positiva de los genes de citocinas y quimiocinas para reclutar otras células inmunes del lado de las inflamaciones; y la expresión de genes que controlan la capacidad migratoria. Las CD activadas tempranamente pueden migrar de los tejidos no linfoides a los ganglios linfáticos, donde pueden preparar las respuestas de las células T. Estas respuestas tempranas de las CD están relacionadas con la inmunidad innata y consisten en la "respuesta transcripcional central" de las CD. Las respuestas específicas de los patógenos tienen una influencia más fuerte en la capacidad de las CD para regular la inmunidad adaptativa.
La comparación de las diferencias entre el programa transcripcional general de las células inmunitarias puede generar gráficos que ubiquen cada tipo de célula de la mejor manera posible para reflejar su perfil de expresión en relación con el resto de células y puede revelar relaciones interesantes entre los tipos de células. Por ejemplo, los perfiles transcripcionales de las células inmunitarias epiteliales medulares del timo se mapearon más cerca de los linfocitos que de otros epitelios. Esto puede sugerir que existe una interacción funcional entre estos dos tipos de células y requiere el intercambio de transcripciones y proteínas particulares. Al comparar los perfiles de expresión génica de las células del sistema sanguíneo, los subconjuntos de células T y B se agrupan estrechamente con sus respectivos tipos de células.
Al observar el perfil transcripcional de diferentes células T, los científicos han demostrado que las células T asesinas naturales son una variante cercana de las células T CD4+ convencionales , en lugar de un tipo de célula intermedia entre las células T y las células asesinas naturales . Además, las células dendríticas, las células asesinas naturales y las células B están estrechamente agrupadas en función de sus perfiles de expresión global. Podría haberse esperado que los linfocitos B y los linfocitos T se agruparan por separado unos de otros, o que las células asesinas naturales estuvieran más estrechamente relacionadas con las células T porque comparten precursores comunes, actividad citolítica y marcadores de activación similares. Por lo tanto, la inmunómica ha establecido una relación entre linajes celulares que se aparta de los puntos de vista clásicos. Además, puede explicar mejor la plasticidad observada en la diferenciación de células linfoides y mieloides debido a la superposición considerable entre los perfiles de expresión global de estos diferentes linajes. [14]
Las redes representan el nivel más amplio de interacciones genéticas y tienen como objetivo vincular todos los genes y transcripciones en el genoma inmunológico. Los fenotipos celulares y los estados de diferenciación se establecen en última instancia por la actividad de estas redes de genes co-regulados. Una de las redes más completas en inmunología ha descifrado conexiones reguladoras entre células B humanas normales y transformadas. Este análisis sugiere una red jerárquica donde un pequeño número de genes altamente conectados (llamados "centros") regulan la mayoría de las interacciones. El proto- oncogén MYC surgió como un centro importante y un regulador altamente influyente para las células B. En particular, se encontró que MYC controlaba directamente BYSL , un gen altamente conservado, pero pobremente caracterizado, y es el centro más grande en toda la red de células B. Esto sugiere que BYSL codifica una molécula celular importante y un efector crítico de la función de MYC, y motiva estudios adicionales para dilucidar su función. Por lo tanto, el uso de datos de expresión genética para crear redes puede revelar genes altamente influyentes en la diferenciación de células inmunes que las tecnologías pregenómicas aún no habían identificado. [14]
Como citan Stefania Bambini y Rino Rappuoli, “Las nuevas y poderosas tecnologías genómicas han aumentado el número de enfermedades que se pueden abordar mediante la vacunación y han disminuido el tiempo para descubrir la investigación y el desarrollo de vacunas ”. La disponibilidad de secuencias genómicas completas de patógenos en combinación con tecnologías genómicas de alto rendimiento han ayudado a acelerar el desarrollo de vacunas. La vaccinología inversa utiliza secuencias genómicas de patógenos virales, bacterianos o parasitarios para identificar genes que potencialmente codifican genes que promueven la patogénesis . [15] La primera aplicación de la vaccinología inversa identificó candidatos a vacunas contra Neisseria meningitidis serogrupo B. Las herramientas computacionales identificaron 600 proteínas putativas expuestas a la superficie o secretadas de la secuencia completa del genoma de una cepa patógena MenB, sobre la base de las características de la secuencia. Estas proteínas putativas se expresaron en E. coli, se purificaron y se usaron para inmunizar ratones. Las pruebas que utilizaron sueros inmunes de ratones estimaron la capacidad de los anticuerpos para proteger contra estas proteínas. Se verificó la conservación de secuencias de las proteínas capaces de generar una respuesta inmunitaria robusta en un panel de cepas de meningitis, lo que permitió una mayor selección de antígenos capaces de generar una respuesta inmunitaria contra la mayoría de las cepas del panel. Sobre la base de estas secuencias de antígenos, los científicos han podido desarrollar una vacuna "cóctel" universal contra Neisseria meninitidis que utiliza cinco antígenos para promover la inmunidad. [16] Se han utilizado enfoques similares para una variedad de otros patógenos humanos, como Streptococcus pneumoniae , Chlamydia pneumoniae , Bacillus anthracis , Porphyromonas gingivalis , Mycobacterium tuberculosis y Helicobacter pylori , entre otros. Además, se han iniciado estudios para el desarrollo de vacunas contra virus.
El inventario de receptores y vías de transducción de señales que utilizan las células inmunitarias para controlar y defender el organismo da lugar a patrones característicos de expresión génica alterada en las células de sangre periférica que reflejan el carácter de la infección o lesión. Por lo tanto, reconocer los perfiles de expresión característicos de las células de sangre periférica puede ser una poderosa herramienta de diagnóstico al reclutar a estas células como "espías" para detectar enfermedades ocultas o agentes que no se pueden cultivar fácilmente a partir del huésped.
Por ejemplo, la infección de fibroblastos por citomegalovirus (CMV) y la infección de linfocitos T por HTLV-I revelaron perfiles de expresión génica distintos. La infección por CMV provocó una respuesta de interferón única, mientras que la infección por HTLV-1 indujo genes diana NF-kB. También se han probado un tipo de glóbulos blancos contra la exposición bacteriana y la expresión del inmunoma varió según el tipo de cepa bacteriana utilizada.
El seguimiento de los cambios en la expresión de genes en sangre periférica también puede ayudar a determinar el curso de la infección y a tratar a los pacientes con una terapia adaptada a la etapa de su enfermedad. Este enfoque ya se ha utilizado contra la sepsis, una enfermedad que progresa a través de una línea predecible de eventos. Los cambios en las firmas de expresión de genes pueden preceder a la exacerbación clínica de los síntomas, como en la esclerosis múltiple , y permitir a los médicos cortar de raíz estos "brotes". [1]
El sistema inmunológico es una red de vías genéticas y de señalización conectadas por una red de células que interactúan. El Proyecto Genoma Inmunológico busca generar un compendio completo de la expresión de genes codificadores de proteínas para todas las poblaciones celulares del sistema inmunológico del ratón. Analiza tanto las condiciones de estado estable dentro de diferentes poblaciones celulares como la respuesta a perturbaciones genéticas y/o ambientales creadas por polimorfismo genético natural, inactivación de genes, inactivación de genes mediante RNAi o tratamiento farmacológico. Las herramientas computacionales para realizar ingeniería inversa o predecir redes reguladoras de células inmunes utilizan estos perfiles de expresión.
En 2008, el proyecto ImmGen involucró a siete laboratorios de inmunología y tres de biología computacional en Estados Unidos y se habían identificado y descrito más de 200 poblaciones celulares involucradas en el sistema inmunológico. Este consorcio ha creado un navegador de datos para explorar los patrones de expresión de genes particulares, redes de genes corregulados y genes que pueden distinguir de manera confiable los tipos de células. Los datos sin procesar también están disponibles desde el Gene Expression Omnibus del NCBI. [17] [18]
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