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Ratón noqueador

Un ratón knockout , o ratón knock-out , es un ratón modificado genéticamente ( Mus musculus ) en el que los investigadores han inactivado, o " eliminado ", un gen existente reemplazándolo o alterándolo con un fragmento artificial de ADN . Son modelos animales importantes para estudiar el papel de los genes que han sido secuenciados pero cuyas funciones no han sido determinadas. Al hacer que un gen específico sea inactivo en el ratón y observar cualquier diferencia con respecto al comportamiento o la fisiología normales, los investigadores pueden inferir su función probable.

Los ratones son actualmente la especie animal de laboratorio más cercana a los humanos en la que la técnica de knockout puede aplicarse fácilmente. Se utilizan ampliamente en experimentos de knockout, especialmente en aquellos que investigan cuestiones genéticas relacionadas con la fisiología humana . El knockout genético en ratas es mucho más difícil y solo ha sido posible desde 2003. [1] [2]

El primer ratón knock-out del que se tiene registro fue creado por Mario R. Capecchi , Martin Evans y Oliver Smithies en 1989, por lo que recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2007. Algunos aspectos de la tecnología para generar ratones knock-out y los propios ratones han sido patentados en muchos países por empresas privadas.

Usar

Se muestra un ratón de laboratorio en el que se ha eliminado un gen que afecta el crecimiento del cabello (izquierda) junto a un ratón de laboratorio normal.

La eliminación de la actividad de un gen proporciona información sobre lo que ese gen hace normalmente. Los humanos compartimos muchos genes con los ratones. En consecuencia, la observación de las características de los ratones knockout proporciona a los investigadores información que puede utilizarse para comprender mejor cómo un gen similar puede causar o contribuir a la aparición de enfermedades en los humanos.

Entre los ejemplos de investigaciones en las que los ratones knockout han sido útiles se incluyen el estudio y la modelización de diferentes tipos de cáncer , obesidad , enfermedades cardíacas , diabetes , artritis , abuso de sustancias , ansiedad , envejecimiento y enfermedad de Parkinson . Los ratones knockout también ofrecen un contexto biológico y científico en el que se pueden desarrollar y probar medicamentos y otras terapias.

Cada año se utilizan millones de ratones knock-out en experimentos. [3]

Presiones

Un ratón knockout (izquierda) que es un modelo de obesidad, comparado con un ratón normal

Existen miles de cepas diferentes de ratones knock-out. [3] Muchos modelos de ratón reciben su nombre del gen que ha sido inactivado. Por ejemplo, el ratón knock-out p53 recibe su nombre del gen p53 que codifica una proteína que normalmente suprime el crecimiento de tumores deteniendo la división celular y/o induciendo la apoptosis. Los humanos nacidos con mutaciones que desactivan el gen p53 padecen el síndrome de Li-Fraumeni , una afección que aumenta drásticamente el riesgo de desarrollar cánceres de huesos, cáncer de mama y cánceres de sangre a una edad temprana. Otros modelos de ratón reciben su nombre de acuerdo con sus características físicas o comportamientos.

Procedimiento

El procedimiento para hacer blastocisto de genotipo mixto
Esquema de crianza para producir ratones knock-out. Los blastocistos que contienen células, que son tanto células de tipo salvaje como células knock-out, se inyectan en el útero de una madre adoptiva. Esto produce crías que son de tipo salvaje y del mismo color que el donante de blastocisto (gris) o quimeras (mixtas) y parcialmente knock-out. Los ratones quimeras se cruzan con un ratón de tipo salvaje normal (gris). Esto produce crías que son blancas y heterocigotas para el gen knock-out o grises y de tipo salvaje. Los ratones heterocigotos blancos pueden cruzarse posteriormente para producir ratones que sean homocigotos para el gen knock-out.

Existen varias variaciones en el procedimiento de producción de ratones knockout; el siguiente es un ejemplo típico.

  1. El gen que se va a eliminar se aísla de una biblioteca de genes de ratón. Luego se diseña una nueva secuencia de ADN que es muy similar al gen original y su secuencia vecina inmediata, excepto que se modifica lo suficiente como para hacer que el gen sea inoperable. Por lo general, a la nueva secuencia también se le asigna un gen marcador , un gen que los ratones normales no tienen y que confiere resistencia a un determinado agente tóxico (p. ej., neomicina) o que produce un cambio observable (p. ej. color o fluorescencia). Además, también se incluye un segundo gen, como herpes tk+, en la construcción para lograr una selección completa.
  2. Las células madre embrionarias se aíslan de un blastocisto de ratón (un embrión muy joven ) y se cultivan in vitro . Para este ejemplo, tomaremos células madre de un ratón blanco.
  3. La nueva secuencia del paso 1 se introduce en las células madre del paso 2 mediante electroporación . Mediante el proceso natural de recombinación homóloga, algunas de las células madre electroporadas incorporarán la nueva secuencia con el gen eliminado en sus cromosomas en lugar del gen original. Las posibilidades de un evento de recombinación exitoso son relativamente bajas, por lo que la mayoría de las células alteradas tendrán la nueva secuencia en solo uno de los dos cromosomas relevantes: se dice que son heterocigotas . Las células que se transformaron con un vector que contiene el gen de resistencia a la neomicina y el gen del herpes tk+ se cultivan en una solución que contiene neomicina y Ganciclovir para seleccionar las transformaciones que ocurrieron mediante recombinación homóloga. Cualquier inserción de ADN que se produjo mediante inserción aleatoria morirá porque da positivo tanto para el gen de resistencia a la neomicina como para el gen del herpes tk+, cuyo producto génico reacciona con el Ganciclovir para producir una toxina mortal. Además, las células que no integran ninguno de los materiales genéticos dan negativo en ambos genes y, por lo tanto, mueren como resultado del envenenamiento con neomicina.
  4. Las células madre embrionarias que incorporan el gen eliminado se aíslan de las células inalteradas utilizando el gen marcador del paso 1. Por ejemplo, las células inalteradas pueden eliminarse utilizando un agente tóxico al que las células alteradas sean resistentes.
  5. Las células madre embrionarias eliminadas del paso 4 se insertan en un blastocisto de ratón . Para este ejemplo, utilizamos blastocistos de un ratón gris. Los blastocistos contienen ahora dos tipos de células madre: las originales (del ratón gris) y las células eliminadas (del ratón blanco). Estos blastocistos se implantan luego en el útero de ratones hembra, donde se desarrollan. Por lo tanto, los ratones recién nacidos serán quimeras : algunas partes de sus cuerpos son el resultado de las células madre originales, otras partes de las células madre eliminadas. Su pelaje mostrará manchas blancas y grises, con manchas blancas derivadas de las células madre eliminadas y manchas grises del blastocisto receptor.
  6. Algunos de los ratones quimera recién nacidos tendrán gónadas derivadas de células madre eliminadas y, por lo tanto, producirán óvulos o espermatozoides que contengan el gen eliminado. Cuando estos ratones quimera se cruzan con otros del tipo salvaje, algunas de sus crías tendrán una copia del gen eliminado en todas sus células. Estos ratones no conservan ningún ADN de ratón gris y no son quimeras, sin embargo, siguen siendo heterocigotos.
  7. Cuando estos descendientes heterocigotos se cruzan, algunos de ellos heredarán el gen eliminado de ambos padres; no llevarán ninguna copia funcional del gen original inalterado (es decir, serán homocigotos para ese alelo).

Una explicación detallada de cómo se crean los ratones knockout (KO) se encuentra en el sitio web del Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2007. [4]

Limitaciones

Los Institutos Nacionales de Salud analizan algunas limitaciones importantes de esta técnica. [5]

Aunque la tecnología de ratones knock-out representa una valiosa herramienta de investigación, existen algunas limitaciones importantes. Alrededor del 15 por ciento de los knock-outs genéticos son letales para el desarrollo, lo que significa que los embriones genéticamente alterados no pueden convertirse en ratones adultos. Este problema se suele superar mediante el uso de mutaciones condicionales . La falta de ratones adultos limita los estudios al desarrollo embrionario y a menudo hace más difícil determinar la función de un gen en relación con la salud humana . En algunos casos, el gen puede cumplir una función diferente en adultos que en embriones en desarrollo.

La eliminación de un gen también puede no producir un cambio observable en un ratón o incluso puede producir características diferentes de las observadas en humanos en los que el mismo gen está inactivado. Por ejemplo, las mutaciones en el gen p53 están asociadas con más de la mitad de los cánceres humanos y a menudo conducen a tumores en un conjunto particular de tejidos. Sin embargo, cuando se elimina el gen p53 en ratones, los animales desarrollan tumores en un conjunto diferente de tejidos.

Existe una variabilidad en todo el procedimiento que depende en gran medida de la cepa de la que se han derivado las células madre. Generalmente se utilizan células derivadas de la cepa 129. Esta cepa específica no es adecuada para muchos experimentos (por ejemplo, de comportamiento), por lo que es muy común retrocruzar la descendencia con otras cepas. Se ha demostrado que algunos loci genómicos son muy difíciles de eliminar. Las razones pueden ser la presencia de secuencias repetitivas, una extensa metilación del ADN o heterocromatina . La presencia confusa de genes 129 vecinos en el segmento eliminado del material genético se ha denominado "efecto del gen flanqueador". [6] Se han propuesto métodos y pautas para abordar este problema. [7] [8]

Otra limitación es que los ratones knock-out convencionales (es decir, no condicionales) se desarrollan en ausencia del gen que se está investigando. A veces, la pérdida de actividad durante el desarrollo puede enmascarar el papel del gen en el estado adulto, especialmente si el gen está involucrado en numerosos procesos que abarcan el desarrollo. En ese caso, se requieren métodos de mutación condicional/inducible que primero permitan que el ratón se desarrolle y madure normalmente antes de la ablación del gen de interés.

Otra limitación grave es la falta de adaptaciones evolutivas en el modelo knockout que podrían ocurrir en animales de tipo salvaje después de que mutan naturalmente. Por ejemplo, la coexpresión específica de GLUT1 en los eritrocitos con estomatina constituye un mecanismo compensatorio en mamíferos que no pueden sintetizar vitamina C. [ 9]

Véase también

Referencias

  1. ^ Pilcher HR (19 de mayo de 2003). "Es un nocaut". Nature . doi :10.1038/news030512-17 . Consultado el 3 de abril de 2014 .
  2. ^ Zan Y, Haag JD, Chen KS, Shepel LA, Wigington D, Wang YR, Hu R, Lopez-Guajardo CC, Brose HL, Porter KI, Leonard RA, Hitt AA, Schommer SL, Elegbede AF, Gould MN (junio de 2003). "Producción de ratas knock-out utilizando mutagénesis ENU y un ensayo de detección basado en levadura". Nature Biotechnology . 21 (6): 645–51. doi :10.1038/nbt830. PMID  12754522. S2CID  32611710.
  3. ^ ab Spencer G (diciembre de 2002). "Antecedentes sobre el ratón como organismo modelo". Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano . Consultado el 3 de abril de 2014 .
  4. ^ "El Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2007". Nobelprize.org. 19 de septiembre de 1985. Consultado el 3 de abril de 2014 .
  5. ^ "Hoja informativa sobre ratones knockout". Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano. Agosto de 2015. Consultado el 3 de abril de 2014 .
  6. ^ Gerlai R (mayo de 1996). "Estudios de la conducta de los mamíferos dirigidos a genes: ¿es la mutación o el genotipo de fondo?". Tendencias en neurociencias . 19 (5): 177–81. doi :10.1016/S0166-2236(96)20020-7. PMID  8723200. S2CID  33396039.
  7. ^ Wolfer DP, Crusio WE , Lipp HP (julio de 2002). "Ratones knock-out: soluciones simples a los problemas de antecedentes genéticos y genes flanqueantes". Tendencias en neurociencias . 25 (7): 336–40. doi :10.1016/S0166-2236(02)02192-6. PMID  12079755. S2CID  33777888.
  8. ^ Crusio WE, Goldowitz D, Holmes A, Wolfer D (febrero de 2009). "Estándares para la publicación de estudios sobre mutantes en ratones". Genes, cerebro y comportamiento . 8 (1): 1–4. doi : 10.1111/j.1601-183X.2008.00438.x . PMID  18778401. S2CID  205853147.
  9. ^ Montel-Hagen A, Kinet S, Manel N, Mongellaz C, Prohaska R, Battini JL, Delaunay J, Sitbon M, Taylor N (marzo de 2008). "El Glut1 de los eritrocitos desencadena la captación de ácido deshidroascórbico en mamíferos incapaces de sintetizar vitamina C". Cell . 132 (6): 1039–48. doi : 10.1016/j.cell.2008.01.042 . PMID  18358815.

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