Microscopía holográfica digital

Grabado químico medido en tiempo real

Figura 1. Imagen de cambio de fase DHM de detalles celulares.

Medición del acabado superficial

La microscopía holográfica digital ( DHM ) es la holografía digital aplicada a la microscopía . La microscopía holográfica digital se distingue de otros métodos de microscopía al no registrar la imagen proyectada del objeto. En cambio, la información del frente de onda de luz que se origina en el objeto se registra digitalmente como un holograma , a partir del cual una computadora calcula la imagen del objeto utilizando un algoritmo de reconstrucción numérica. De este modo, la lente formadora de imágenes en la microscopía tradicional se reemplaza por un algoritmo informático. Otros métodos de microscopía estrechamente relacionados con la microscopía holográfica digital son la microscopía interferométrica , la tomografía de coherencia óptica y la microscopía de fase de difracción. Todos los métodos tienen en común el uso de un frente de onda de referencia para obtener información de amplitud (intensidad) y fase . La información se registra en un sensor de imagen digital o mediante un fotodetector a partir del cual se crea (reconstruye) una imagen del objeto mediante una computadora. En la microscopía tradicional, que no utiliza un frente de onda de referencia, solo se registra la información de intensidad y se pierde información esencial sobre el objeto.

La holografía fue inventada por Dennis Gabor para mejorar la microscopía electrónica . ^[1] Sin embargo, nunca encontró muchas aplicaciones concretas e industriales en este campo.

En realidad, la DHM se ha aplicado principalmente a la microscopía óptica. En este campo, ha demostrado aplicaciones únicas para la caracterización 3D de muestras técnicas y permite la caracterización cuantitativa de células vivas. En la ciencia de los materiales , la DHM se utiliza rutinariamente para la investigación en laboratorios académicos e industriales. Dependiendo de la aplicación, los microscopios se pueden configurar tanto para fines de transmisión como de reflexión. La DHM es una solución única para la caracterización 4D (3D + tiempo) de muestras técnicas, cuando es necesario adquirir información en un intervalo de tiempo corto. Es el caso de las mediciones en entornos ruidosos, en presencia de vibraciones, cuando las muestras se mueven o cuando la forma de las muestras cambia debido a estímulos externos, como fuerzas mecánicas, eléctricas o magnéticas, erosión química o deposición y evaporación. En las ciencias de la vida, la DHM generalmente se configura en modo de transmisión. Esto permite la medición de fase cuantitativa (QPM) sin etiquetas, también llamada imágenes de fase cuantitativa (QPI), de células vivas. Las mediciones no afectan a las células, lo que permite estudios a largo plazo. Proporciona información que puede interpretarse en muchos procesos biológicos subyacentes, como se explica en la sección "Imágenes de células vivas" a continuación.

Principio de funcionamiento

Figura 2. Configuración óptica típica de DHM.

Para crear el patrón de interferencia necesario , es decir, el holograma, la iluminación debe ser una fuente de luz coherente (monocromática), por ejemplo un láser . Como se puede ver en la Figura 2, la luz láser se divide en un haz de objeto y un haz de referencia. El haz de objeto expandido ilumina la muestra para crear el frente de onda del objeto. Después de que el frente de onda del objeto es recogido por un objetivo de microscopio , los frentes de onda del objeto y de referencia se unen mediante un divisor de haz para interferir y crear el holograma. Utilizando el holograma grabado digitalmente, una computadora actúa como una lente digital y calcula una imagen visible del frente de onda del objeto utilizando un algoritmo de reconstrucción numérica.

Por lo general, se utiliza un objetivo de microscopio para captar el frente de onda del objeto. Sin embargo, como el objetivo del microscopio solo se utiliza para captar luz y no para formar una imagen, se puede reemplazar por una lente simple. Si se acepta una resolución óptica ligeramente inferior, se puede quitar por completo el objetivo del microscopio.

La holografía digital se presenta en diferentes formas, como Fresnel fuera de eje , Fourier , plano de imagen , en línea , Gabor y holografía digital por desplazamiento de fase ^[2] , según la configuración óptica. Sin embargo, el principio básico es el mismo: se graba un holograma y se reconstruye una imagen mediante una computadora.

La resolución óptica lateral de la microscopía holográfica digital es equivalente a la resolución de la microscopía óptica tradicional . La DHM está limitada por difracción por la apertura numérica , de la misma manera que la microscopía óptica tradicional. Sin embargo, la DHM ofrece una excelente resolución axial (de profundidad). Se ha informado de una precisión axial de aproximadamente 5 nm. ^[3]

Ventajas

Figura 3. Comparación de una imagen de desplazamiento de fase DHM (izquierda) y una imagen de microscopía de contraste de fase (derecha).

Imágenes de desplazamiento de fase
Además de la imagen de campo claro habitual , también se crea una imagen de desplazamiento de fase . La imagen de desplazamiento de fase es exclusiva de la microscopía holográfica digital y proporciona información cuantificable sobre la distancia óptica . En la microscopía holográfica digital de reflexión, la imagen de desplazamiento de fase forma una imagen topográfica del objeto.

Los objetos transparentes, como las células biológicas vivas , se observan tradicionalmente en un microscopio de contraste de fases o en un microscopio de contraste de interferencia diferencial . Estos métodos visualizan objetos transparentes con desplazamiento de fase distorsionando la imagen de campo claro con información de desplazamiento de fase. En lugar de distorsionar la imagen de campo claro, la microscopía holográfica digital de transmisión crea una imagen de desplazamiento de fase separada que muestra el espesor óptico del objeto. La microscopía holográfica digital permite visualizar y cuantificar objetos transparentes y, por lo tanto, también se denomina microscopía cuantitativa de contraste de fases .

Las imágenes tradicionales de contraste de fase o de campo claro de células biológicas vivas no teñidas, Figura 3 (derecha), han demostrado ser muy difíciles de analizar con software de análisis de imágenes . Por el contrario, las imágenes de cambio de fase, Figura 3 (izquierda), se segmentan y analizan fácilmente con software de análisis de imágenes basado en morfología matemática , como CellProfiler . ^[4]

Información tridimensional
La imagen de un objeto se calcula a una distancia focal determinada . Sin embargo, como el holograma grabado contiene toda la información necesaria sobre el frente de onda del objeto, es posible calcular el objeto en cualquier plano focal modificando el parámetro de distancia focal en el algoritmo de reconstrucción. De hecho, el holograma contiene toda la información necesaria para calcular una pila de imágenes completa . En un sistema DHM, donde el frente de onda del objeto se registra desde múltiples ángulos, es posible caracterizar completamente las características ópticas del objeto y crear imágenes tomográficas del objeto. ^{[5] [6]}

Enfoque automático digital El enfoque automático
convencional se logra modificando verticalmente la distancia focal hasta encontrar un plano de imagen enfocado. Como la pila completa de planos de imagen se puede calcular a partir de un único holograma, es posible utilizar cualquier método de enfoque automático pasivo para seleccionar digitalmente el plano focal. ^[7] Las capacidades de enfoque automático digital de la holografía digital abren la posibilidad de escanear y obtener imágenes de superficies de manera extremadamente rápida, sin ningún movimiento mecánico vertical. Al registrar un único holograma y luego unir subimágenes que se calculan en diferentes planos focales, se puede crear una imagen completa y enfocada del objeto. ^[8]

Corrección de aberraciones ópticas
Como los sistemas DHM no tienen una lente formadora de imágenes, las aberraciones ópticas tradicionales no se aplican a los DHM. Las aberraciones ópticas se "corrigen" mediante el diseño del algoritmo de reconstrucción. Un algoritmo de reconstrucción que realmente modele la configuración óptica no sufrirá aberraciones ópticas. ^{[9] [10]}

Bajo costo
En los sistemas de microscopía óptica , las aberraciones ópticas se corrigen tradicionalmente combinando lentes en un objetivo de microscopio de formación de imágenes complejo y costoso. Además, la estrecha profundidad focal a grandes aumentos requiere una mecánica de precisión. Los componentes necesarios para un sistema DHM son componentes ópticos y semiconductores económicos, como un diodo láser y un sensor de imagen . El bajo costo de los componentes en combinación con las capacidades de enfoque automático del DHM, hacen posible fabricar sistemas DHM a un costo muy bajo. ^{[11] [12]}

Aplicaciones

Figura 4. Imagen de cambio de fase DHM de glóbulos rojos humanos .

La microscopía holográfica digital se ha aplicado con éxito en una variedad de áreas de aplicación. ^[13]

Imágenes de células vivas

Sin embargo, debido a la capacidad del DHM de visualizar y cuantificar de forma no invasiva el tejido biológico, las aplicaciones biomédicas han recibido la mayor atención. ^[14] Algunos ejemplos de aplicaciones biomédicas son:

• Recuento de células sin etiquetas en cultivos celulares adherentes . La microscopía holográfica digital permite realizar el recuento de células y medir la viabilidad celular directamente en la cámara de cultivo celular. ^{[15] [16]} Hoy en día, los métodos de recuento de células más utilizados, el hemocitómetro o el contador Coulter , solo funcionan con células que están en suspensión.
• Análisis de viabilidad sin etiquetas de cultivos de células adherentes. ^{[17] [18]} La holografía digital se ha utilizado para estudiar el proceso apoptótico en diferentes tipos de células. Los cambios del índice de refracción que tienen lugar durante el proceso apoptótico se miden fácilmente con DHM.
• Análisis del ciclo celular sin etiquetas . Se ha demostrado que el cambio de fase inducido por las células está correlacionado con la masa seca celular. La masa seca celular se puede combinar con otros parámetros que se pueden obtener mediante holografía digital, como el volumen celular y el índice de refracción, para proporcionar una mejor comprensión del ciclo celular. ^[19]
• Análisis de la morfología celular sin marcaje. La holografía digital se ha utilizado en diferentes contextos para estudiar la morfología celular sin utilizar tinción ni marcaje. ^[16] Esto se puede utilizar para seguir procesos como el proceso de diferenciación donde cambian las características celulares. La holografía digital también se ha utilizado para el seguimiento automatizado de células madre de plantas y ha hecho posible distinguir entre dos tipos de células madre midiendo parámetros morfológicos. ^[20]
• Estudios de células nerviosas sin necesidad de etiquetar . La microscopía holográfica digital permite estudiar procesos inalterados en las células nerviosas, ya que no se requiere etiquetar. ^[21] La hinchazón y el cambio de forma de las células nerviosas causados ​​por el desequilibrio celular se estudiaron fácilmente.

Figura 5. Lapso de tiempo de células no teñidas, en división y migración.

• Análisis de alto contenido sin etiquetas . El análisis/cribado de alto contenido fluorescente tiene varias desventajas. Por lo tanto, se han propuesto alternativas sin etiquetas basadas en imágenes de cambio de fase. ^[4] La capacidad de DHM para obtener imágenes de cambio de fase rápidamente en áreas extensas abre nuevas posibilidades de caracterización cuantitativa muy rápida del ciclo celular y los efectos de agentes farmacológicos específicos.
• Análisis de glóbulos rojos . Las imágenes de cambio de fase se han utilizado para estudiar la dinámica de los glóbulos rojos. ^{[22] [23]} El volumen de glóbulos rojos y la concentración de hemoglobina se han medido combinando información de imágenes de absorción y de cambio de fase para facilitar el recuento completo de células sanguíneas mediante microscopía holográfica. ^[24] Además, se ha demostrado ^[25] que la información de cambio de fase discrimina entre glóbulos rojos inmaduros y maduros, lo que facilita el recuento de reticulocitos sin teñir .
• Citometría de flujo y seguimiento y caracterización de partículas. Las imágenes creadas por holografía digital se calculan a partir del holograma grabado en cualquier momento después de la grabación real y en cualquier plano focal determinado. Al combinar varias imágenes calculadas a partir del mismo holograma, pero en diferentes planos focales, se puede obtener una mayor profundidad de campo , que es muy superior a lo que se puede lograr con la microscopía óptica tradicional. La mayor profundidad de campo permite obtener imágenes y caracterizar la morfología de las células y partículas mientras están en suspensión. Las observaciones se pueden realizar directamente en uncanal microfluídico o de forma estática en una cámara de observación. ^{[26] [27] [28]}
• Microscopía de lapso de tiempo de división y migración celular. ^[29] Las capacidades de enfoque automático y de imágenes por desplazamiento de fase de la microscopía holográfica digital permiten crear sin esfuerzovideoclips de lapso de tiempo cuantificables y sin etiquetas de células no teñidas para estudios de migración celular . ^[30] En la Figura 5 se muestra un lapso de tiempo sin etiquetas de células en división y migración.
• Estudios de tomografía ^{. [31]} La microscopía holográfica digital permite un análisis cuantificable y sin etiquetas del movimiento subcelular en las profundidades del tejido vivo.

Topografía de superficie 3D

El DHM realiza mediciones estáticas de la topografía de superficies 3D como muchos otros perfilómetros ópticos 3D (interferómetros de luz blanca, confocales, de variación de foco, etc.). Permite recuperar la rugosidad y la forma de muchas superficies. ^{[32] [33] [34]} El uso de múltiples longitudes de onda permite superar el límite de 1/4 de los interferómetros de desplazamiento de fase tradicionales. Se han demostrado aplicaciones en muchas muestras, como implantes médicos, componentes de relojes, microcomponentes y microópticas. ^[35]

Aplicaciones resueltas en el tiempo

Superficie autorreparadora que se recupera de un rasguño: medición en tiempo real

Como DHM mide la topografía de la superficie 3D en todo el campo de visión con una sola adquisición de cámara, no es necesario realizar un escaneo, ni vertical ni lateral. En consecuencia, los cambios dinámicos de la topografía se miden instantáneamente. La velocidad de adquisición solo está limitada por el marco de la cámara. Se han demostrado mediciones en muchos tipos de muestras, como superficies inteligentes, superficies autorreparables, sistemas que no están en equilibrio, procesos de evaporación, electrodeposición, evaporación, cristalización, deformación mecánica, etc. ^{[36] [37]}

MEMS

Transductores ultrasónicos medidos a 8 MHz en modo estroboscópico

El uso en combinación con una unidad electrónica estroboscópica para sincronizar el pulso láser para la iluminación de la muestra y la adquisición de la cámara con la excitación MEMS, proporciona secuencias temporales de topografía 3D a lo largo de la fase de excitación de los microsistemas. El análisis de esta secuencia temporal de topografías 3D adquiridas a una frecuencia fija proporciona un mapa de vibración y permite la descomposición del movimiento en términos de dentro y fuera del plano. ^[38]

El barrido de la frecuencia de excitación proporciona resonancias estructurales, así como análisis de Bode de amplitud y fase. ^[39] Se han realizado mediciones en muchos tipos de MEMS, como actuadores de accionamiento de peine, microespejos, acelerómetros, giroscopios, microbombas, micrófonos, transductores ultrasónicos, voladizos y ondas acústicas de superficie, entre otros. ^{[40] [41] [42] [43] [44] [45] [46]}

Metrología

El DHM se refiere únicamente a longitudes de onda para la medición de altura. Por lo tanto, el DHM proporciona mediciones de altura precisas con una repetibilidad y linealidad muy altas independientemente de cualquier calibración vertical, posicionamiento preciso de la pieza mecánica, repetibilidad del controlador piezoeléctrico interferométrico, desplazamiento motorizado o escaneo de pantalla de cristal líquido. Esta característica hace del DHM una herramienta destacada para la certificación de rugosidad y escalón, entre otras. Para los sistemas de transmisión, la calibración de planitud perfecta se logra tomando como referencia una adquisición sin ninguna muestra en el camino óptico. La calibración de planitud de los sistemas de tipo reflexión requiere el uso de una muestra perfectamente plana. ^[47]

Inspección industrial

Medición automática de prótesis de cadera: caracterización de la rugosidad superficial

El tiempo muy breve necesario para capturar la información hace que el DHM sea muy resistente a las vibraciones ambientales. Permite, en particular, controles de calidad de piezas “en vuelo” y “en línea”. Se han demostrado aplicaciones en particular para la rugosidad de implantes, la estructura de componentes semiconductores, la industria solar, la metrología industrial y las piezas de relojería, entre otros. ^{[48] [49]}

Microóptica

Se ha demostrado que la medición e inspección rápidas mediante matrices de microóptica se han comparado con éxito con la medición realizada con otros perfilómetros. ^{[50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58]}

Los algoritmos de profundidad de enfoque extendida basados ​​en focalización digital permiten tener un enfoque nítido sobre toda la superficie de la lente, incluso para muestras de alta apertura numérica. ^[59] La DHM también se ha aplicado a la caracterización dinámica de lentes variables. ^[53]

Seguimiento de partículas en 3D

El seguimiento de partículas en 3D se ha demostrado en numerosas publicaciones [por completar]. Se puede reconstruir digitalmente una pila Z de mediciones a partir de un único holograma utilizando un rango de distancias de propagación. Algoritmos específicos permiten determinar para cada partícula la distancia correspondiente a su mejor foco. Realizar esta operación en una secuencia temporal de hologramas permite determinar las trayectorias de las partículas.

Historia

Los primeros informes sobre la sustitución del holograma fotográfico de la holografía clásica por el registro digital del holograma y la reconstrucción numérica de la imagen en una computadora se publicaron a fines de la década de 1960 ^[60] y principios de la década de 1970. ^{[61] [62]} Se propusieron ideas similares para el microscopio electrónico a principios de la década de 1980. ^[63] Pero las computadoras eran demasiado lentas y las capacidades de registro eran demasiado pobres para que la holografía digital fuera útil en la práctica. Después del entusiasmo inicial, la holografía digital entró en una hibernación similar a la que había experimentado la holografía unas dos décadas antes. (Tenga en cuenta que en la década de 1960, "holografía digital" podía significar calcular una imagen a partir de un holograma o calcular un holograma a partir de un modelo 3D. Este último se desarrolló en paralelo con la holografía clásica durante el paréntesis, y durante ese tiempo, "holografía digital" era sinónimo de lo que ahora se conoce como holografía generada por computadora ).

A mediados de los años 1990, los sensores de imagen digital y las computadoras se habían vuelto lo suficientemente potentes como para reconstruir imágenes con cierta calidad, ^[64] pero aún carecían del recuento de píxeles y la densidad necesarios para que la holografía digital fuera algo más que una curiosidad. En ese momento, el mercado que impulsaba los sensores de imagen digital era principalmente el video de baja resolución, por lo que esos sensores solo proporcionaban resolución PAL , NTSC o SECAM . Esto cambió repentinamente a principios del siglo XXI con la introducción de las cámaras digitales de imagen fija , que impulsaron la demanda de sensores económicos de alto recuento de píxeles. A partir de 2010, los sensores de imagen asequibles pueden tener hasta 60 megapíxeles. Además, el mercado de reproductores de CD y DVD ha impulsado el desarrollo de láseres de diodo y ópticas asequibles.

Los primeros informes sobre el uso de la holografía digital para la microscopía óptica se produjeron a mediados de la década de 1990. ^{[65] [66]} Sin embargo, no fue hasta principios de la década de 2000 que la tecnología de sensores de imagen había progresado lo suficiente como para permitir imágenes de una calidad razonable. Durante este tiempo, se fundaron las primeras empresas comerciales de microscopía holográfica digital. Con el aumento de la potencia informática y el uso de sensores y láseres de alta resolución de bajo costo, la microscopía holográfica digital está encontrando hoy aplicaciones principalmente en las ciencias de la vida, la oceanología y la metrología .

Véase también

• Holografía digital
• Microscopía cuantitativa de contraste de fases
• Interferometría holográfica
• Holotomografía
• Holografía
• Microscopía

Referencias

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Enlaces externos

• Reunión sobre holografía digital e imágenes tridimensionales organizada por la Sociedad Óptica

Lectura adicional

Libros

• Métodos de holografía digital de LP Yaroslavskii y NS Merzlyakov, Springer (1980)
• Holografía digital y procesamiento de imágenes digitales: principios, métodos y algoritmos de Leonid Yaroslavsky, Kluwer (2004)
• Manual de interferometría holográfica: métodos ópticos y digitales de Thomas Kreis, Wiley (2004)
• Holografía digital de U. Schnars y W. Jueptner, Springer (2005)
• Holografía digital y visualización tridimensional: principios y aplicaciones por Ting-Chung Poon (Editor), Springer (2006)
• Aplicaciones de la microscopía holográfica digital: análisis y seguimiento de objetos tridimensionales, por Cedric Schockaert, VDM Verlag (2009)
• Microscopía holográfica de objetos microscópicos de fase: teoría y práctica por Tatyana Tishko, Tishko Dmitry, Titar Vladimir, World Scientific (2010)
• Imágenes cuantitativas de fase de células y tejidos por Gabriel Popescu, McGraw-Hill (2011)
• Microscopía holográfica digital: principios, técnicas y aplicaciones de Myung K. Kim, Springer (2011)
• Microscopía óptica coherente: obtención de imágenes y análisis cuantitativo de fases, editado por Pietro Ferraro, Springer (2011)
• Holografía digital para MEMS y metrología de microsistemas editado por Erdal Cayirci, Wiley (2011)
• Procesamiento de imágenes para holografía digital , por Karen Molony, VDM Verlag (2011)
• Holografía digital de Pascal Picart y Jun-chang Li, Wiley (2012)

Reseñas

• General: Kim Myung K (2010). "Principios y técnicas de microscopía holográfica digital". Journal of Photonics for Energy . 1 : 018005. Bibcode :2010SPIER...1a8005K. doi : 10.1117/6.0000006 .

Problemas con las funciones

• HOLOGRAFÍA DIGITAL E IMÁGENES 3D editado por Ting-Chung Poon, Applied Optics Vol. 50, Iss. 34 (2011)