El cribado de alto rendimiento ( HTS ) es un método de descubrimiento científico utilizado especialmente en el descubrimiento de fármacos y relevante para los campos de la biología , la ciencia de materiales [1] y la química . [2] [3] Utilizando robótica , software de control/procesamiento de datos, dispositivos de manipulación de líquidos y detectores sensibles, la detección de alto rendimiento permite a un investigador realizar rápidamente millones de pruebas químicas, genéticas o farmacológicas. A través de este proceso se pueden reconocer rápidamente compuestos activos, anticuerpos o genes que modulan una vía biomolecular particular. Los resultados de estos experimentos proporcionan puntos de partida para el diseño de fármacos y para comprender la no interacción o el papel de una ubicación particular.
El material de laboratorio o recipiente de prueba clave de HTS es la placa de microtitulación , que es un recipiente pequeño, generalmente desechable y hecho de plástico, que presenta una rejilla de pequeños hendiduras abiertas llamadas pocillos . En general, las microplacas para HTS tienen 96, 192, 384, 1536, 3456 o 6144 pocillos. Todos estos son múltiplos de 96, lo que refleja la microplaca de 96 pocillos original con pocillos espaciados de 8 x 12 con un espaciado de 9 mm. La mayoría de los pocillos contienen elementos de prueba, según la naturaleza del experimento. Estos podrían ser diferentes compuestos químicos disueltos, por ejemplo, en una solución acuosa de dimetilsulfóxido (DMSO). Los pozos también podrían contener células o enzimas de algún tipo. (Los otros pocillos pueden estar vacíos o contener disolvente puro o muestras sin tratar, destinadas a usarse como controles experimentales ).
Una instalación de detección suele tener una biblioteca de placas de stock , cuyo contenido está cuidadosamente catalogado y cada una de las cuales puede haber sido creada en el laboratorio u obtenida de una fuente comercial. Estas placas madre en sí no se utilizan directamente en experimentos; en su lugar, se crean placas de ensayo separadas según sea necesario. Una placa de ensayo es simplemente una copia de una placa madre, creada pipeteando una pequeña cantidad de líquido (a menudo medida en nanolitros ) desde los pocillos de una placa madre a los pocillos correspondientes de una placa completamente vacía.
Para prepararse para un ensayo , el investigador llena cada pocillo de la placa con alguna entidad biológica sobre la que desea realizar el experimento, como una proteína , células o un embrión animal . Después de que haya pasado un tiempo de incubación para permitir que la materia biológica absorba, se una o reaccione (o no reaccione) con los compuestos en los pocillos, se toman medidas en todos los pocillos de la placa, ya sea manualmente o mediante una máquina. Las mediciones manuales suelen ser necesarias cuando el investigador utiliza la microscopía para (por ejemplo) buscar cambios o defectos en el desarrollo embrionario causados por los compuestos de los pocillos, en busca de efectos que una computadora no podría determinar fácilmente por sí sola. De lo contrario, una máquina de análisis automatizada especializada puede realizar una serie de experimentos en los pocillos (como iluminarlos con luz polarizada y medir la reflectividad, que puede ser una indicación de la unión de proteínas). En este caso, la máquina genera el resultado de cada experimento como una cuadrícula de valores numéricos, y cada número se asigna al valor obtenido de un solo pocillo. Una máquina de análisis de alta capacidad puede medir docenas de placas en el espacio de unos pocos minutos como este, generando miles de puntos de datos experimentales muy rápidamente.
Dependiendo de los resultados de este primer ensayo, el investigador puede realizar ensayos de seguimiento dentro de la misma pantalla "seleccionando" el líquido de los pocillos de origen que dieron resultados interesantes (conocidos como "golpes") en nuevas placas de ensayo y luego volviendo a ejecutarlos. el experimento para recopilar más datos sobre este conjunto reducido, confirmando y refinando las observaciones.
La automatización es un elemento esencial en la utilidad de HTS. Normalmente, un sistema de robot integrado que consta de uno o más robots transporta microplacas de ensayo de una estación a otra para la adición, mezcla, incubación y finalmente lectura o detección de muestras y reactivos. Un sistema HTS normalmente puede preparar, incubar y analizar muchas placas simultáneamente, lo que acelera aún más el proceso de recopilación de datos. Actualmente existen robots HTS que pueden probar hasta 100.000 compuestos por día. [4] [5] Los recolectores automáticos de colonias seleccionan miles de colonias microbianas para un análisis genético de alto rendimiento. [6] El término uHTS o detección de rendimiento ultraalto se refiere (alrededor de 2008) a la detección de más de 100.000 compuestos por día. [7]
Con la capacidad de realizar una detección rápida de diversos compuestos (como moléculas pequeñas o ARNip ) para identificar compuestos activos, HTS ha provocado una explosión en la tasa de datos generados en los últimos años. [8] En consecuencia, uno de los desafíos más fundamentales en los experimentos HTS es obtener significado bioquímico a partir de montones de datos, lo que se basa en el desarrollo y la adopción de diseños experimentales y métodos analíticos apropiados tanto para el control de calidad como para la selección de resultados. [9] La investigación HTS es uno de los campos que tiene una característica descrita por John Blume, director científico de Applied Proteomics, Inc., de la siguiente manera: Pronto, si un científico no comprende algunas estadísticas o tecnologías rudimentarias de manejo de datos, o puede que no sea considerada una verdadera bióloga molecular y, por lo tanto, simplemente se convierta en "un dinosaurio". [10]
Los ensayos HTS de alta calidad son fundamentales en los experimentos HTS. El desarrollo de ensayos HTS de alta calidad requiere la integración de enfoques tanto experimentales como computacionales para el control de calidad (QC). Tres medios importantes de control de calidad son (i) un buen diseño de la placa, (ii) la selección de controles químicos/biológicos positivos y negativos eficaces, y (iii) el desarrollo de métricas de control de calidad eficaces para medir el grado de diferenciación, de modo que los ensayos con datos inferiores Se puede identificar la calidad. [11] Un buen diseño de placa ayuda a identificar errores sistemáticos (especialmente aquellos relacionados con la posición del pozo) y determinar qué normalización se debe utilizar para eliminar/reducir el impacto de los errores sistemáticos tanto en el control de calidad como en la selección de aciertos. [9]
Los métodos analíticos de control de calidad eficaces sirven como guardián de ensayos de excelente calidad. En un experimento HTS típico, una distinción clara entre un control positivo y una referencia negativa, como un control negativo, es un índice de buena calidad. Se han propuesto muchas medidas de evaluación de la calidad para medir el grado de diferenciación entre un control positivo y una referencia negativa. Para evaluar la calidad de los datos se han adoptado la relación señal-fondo, la relación señal-ruido, la ventana de señal, la relación de variabilidad del ensayo y el factor Z. [9] [12] Recientemente se ha propuesto una diferencia de medias estrictamente estandarizada ( SSMD ) para evaluar la calidad de los datos en los ensayos HTS. [13] [14]
Un compuesto con un tamaño de efectos deseado en un HTS se llama éxito. El proceso de selección de resultados se denomina selección de resultados. Los métodos analíticos para la selección de aciertos en pantallas sin réplicas (normalmente en pantallas primarias) difieren de aquellos con réplicas (normalmente en pantallas confirmatorias). Por ejemplo, el método de puntuación z es adecuado para pantallas sin réplicas, mientras que el estadístico t es adecuado para pantallas con réplicas. El cálculo de SSMD para pantallas sin réplicas también difiere del de pantallas con réplicas. [9]
Para la selección de aciertos en pantallas primarias sin réplicas, los fácilmente interpretables son el cambio promedio, la diferencia de medias, el porcentaje de inhibición y el porcentaje de actividad. Sin embargo, no capturan eficazmente la variabilidad de los datos. El método de puntuación z o SSMD, que puede capturar la variabilidad de los datos basándose en el supuesto de que cada compuesto tiene la misma variabilidad que una referencia negativa en las pantallas. [15] [16] Sin embargo, los valores atípicos son comunes en los experimentos HTS, y métodos como el puntaje z son sensibles a los valores atípicos y pueden ser problemáticos. Como consecuencia, se han propuesto y adoptado métodos robustos como el método de puntuación z*, SSMD*, el método de puntuación B y el método basado en cuantiles para la selección de aciertos. [5] [9] [17] [18]
En una pantalla con réplicas, podemos estimar directamente la variabilidad de cada compuesto; como consecuencia, deberíamos utilizar SSMD o estadístico t que no se base en el supuesto fuerte en el que se basan el puntaje z y el puntaje z*. Un problema con el uso del estadístico t y los valores p asociados es que se ven afectados tanto por el tamaño de la muestra como por el tamaño del efecto. [19] Provienen de pruebas sin diferencias medias y, por lo tanto, no están diseñados para medir el tamaño de los efectos compuestos. Para la selección de resultados, el mayor interés es el tamaño del efecto en un compuesto probado. SSMD evalúa directamente el tamaño de los efectos. [20] También se ha demostrado que SSMD es mejor que otros tamaños de efecto comúnmente utilizados. [21] El valor poblacional de SSMD es comparable entre experimentos y, por lo tanto, podemos usar el mismo límite para el valor poblacional de SSMD para medir el tamaño de los efectos compuestos. [22]
Se pueden emplear distribuciones únicas de compuestos en una o varias placas para aumentar el número de ensayos por placa o para reducir la varianza de los resultados del ensayo, o ambas cosas. La suposición simplificadora hecha en este enfoque es que cualquier compuesto N en el mismo pozo normalmente no interactuará entre sí o con el objetivo del ensayo, de una manera que cambie fundamentalmente la capacidad del ensayo para detectar verdaderos resultados.
Por ejemplo, imagine una placa en la que el compuesto A está en los pocillos 1-2-3, el compuesto B está en los pocillos 2-3-4 y el compuesto C está en los pocillos 3-4-5. En un ensayo de esta placa contra un objetivo determinado, un resultado en los pocillos 2, 3 y 4 indicaría que el compuesto B es el agente más probable, al tiempo que proporcionaría tres mediciones de la eficacia del compuesto B contra el objetivo especificado. Las aplicaciones comerciales de este enfoque implican combinaciones en las que dos compuestos nunca comparten más de un pozo, para reducir la posibilidad (de segundo orden) de interferencia entre pares de compuestos que se analizan.
Los científicos del Centro de Genómica Química de los NIH (NCGC) aprovecharon la automatización y los formatos de ensayos de bajo volumen para desarrollar HTS cuantitativo (qHTS), un paradigma para perfilar farmacológicamente grandes bibliotecas químicas mediante la generación de relaciones completas de concentración-respuesta para cada compuesto. Con el software de quimioinformática y ajuste de curvas adjunto, los datos qHTS producen la mitad de la concentración efectiva máxima (EC50), la respuesta máxima y el coeficiente de Hill (nH) para toda la biblioteca, lo que permite la evaluación de las relaciones de actividad de la estructura naciente (SAR). [23]
En marzo de 2010, se publicó una investigación que demuestra un proceso HTS que permite una detección 1000 veces más rápida (100 millones de reacciones en 10 horas) a una millonésima parte del costo (utilizando 10 −7 veces el volumen de reactivo) que las técnicas convencionales que utilizan microfluidos a base de gotas. [23] Las gotas de fluido separadas por el petróleo reemplazan los pocillos de las microplacas y permiten el análisis y la clasificación de impactos mientras los reactivos fluyen a través de los canales.
En 2010, los investigadores desarrollaron una lámina de lentes de silicio que se puede colocar sobre matrices de microfluidos para permitir la medición de la fluorescencia de 64 canales de salida diferentes simultáneamente con una sola cámara. [24] Este proceso puede analizar 200.000 gotas por segundo.
En 2013, los investigadores revelaron un método con pequeñas moléculas de plantas. En general, es esencial proporcionar validaciones de prueba de concepto de alta calidad en las primeras etapas del proceso de descubrimiento de fármacos. En este caso, las tecnologías que permiten la identificación de sondas químicas potentes, selectivas y biodisponibles son de crucial interés, incluso si los compuestos resultantes requieren una mayor optimización para su desarrollo en un producto farmacéutico. El receptor nuclear RORα, una proteína que ha sido objetivo durante más de una década para identificar agonistas potentes y biodisponibles, se utilizó como ejemplo de un objetivo farmacológico muy desafiante. Los aciertos se confirman en el paso de selección gracias a la curva en forma de campana. Este método es muy similar al método cuantitativo HTS (detección y confirmación de acierto al mismo tiempo), excepto que el uso de este enfoque reduce considerablemente el número de puntos de datos y puede detectar fácilmente más de 100.000 compuestos biológicos relevantes. [25]
Mientras que el descubrimiento tradicional de fármacos HTS utiliza proteínas purificadas o células intactas, el desarrollo reciente de la tecnología está asociado con el uso de organismos vivos intactos, como el nematodo Caenorhabditis elegans y el pez cebra ( Danio rerio ). [26]
En 2016-2018, los fabricantes de placas comenzaron a producir química especializada para permitir la producción en masa de superficies repelentes de células con adherencia ultra baja, lo que facilitó el rápido desarrollo de ensayos susceptibles de HTS para abordar el descubrimiento de fármacos contra el cáncer en tejidos 3D, como organoides y esferoides; un formato más fisiológicamente relevante. [27] [28] [29]
HTS es una innovación relativamente reciente, factible en gran medida gracias a los avances modernos en robótica y tecnología informática de alta velocidad. Todavía se necesita un laboratorio de detección altamente especializado y costoso para ejecutar una operación HTS, por lo que en muchos casos una institución de investigación de tamaño pequeño a moderado utilizará los servicios de una instalación HTS existente en lugar de establecer una por sí misma.
Existe una tendencia en el mundo académico a que las universidades sean su propia empresa de descubrimiento de fármacos. [30] Estas instalaciones, que normalmente sólo se encuentran en la industria, ahora se encuentran cada vez más también en las universidades. UCLA , por ejemplo, cuenta con un laboratorio HTS de acceso abierto Molecular Screening Shared Resources (MSSR, UCLA), que puede detectar más de 100.000 compuestos por día de forma rutinaria. La política de acceso abierto garantiza que investigadores de todo el mundo puedan aprovechar esta instalación sin largas negociaciones sobre propiedad intelectual. Con una biblioteca compuesta de más de 200.000 moléculas pequeñas, la MSSR tiene una de las plataformas compuestas más grandes de todas las universidades de la costa oeste. Además, el MSSR presenta capacidades genómicas funcionales completas (ARNip, ARNsh, ADNc y CRISPR de todo el genoma) que son complementarias a los esfuerzos de moléculas pequeñas: La genómica funcional aprovecha las capacidades de HTS para ejecutar pantallas de todo el genoma que examinan la función de cada gen en el contexto de interés. eliminando cada gen o sobreexpresándolo. El acceso paralelo a una pantalla de moléculas pequeñas de alto rendimiento y una pantalla de todo el genoma permite a los investigadores realizar la identificación y validación de objetivos para una enfermedad determinada o la determinación del modo de acción de una molécula pequeña. Los resultados más precisos se pueden obtener mediante el uso de bibliotecas genómicas funcionales "dispuestas", es decir, cada biblioteca contiene una única construcción tal como un único ARNip o ADNc. La genómica funcional suele combinarse con un cribado de alto contenido utilizando, por ejemplo, microscopía epifluorescente o citometría de barrido láser.
La Universidad de Illinois también tiene instalaciones para HTS, al igual que la Universidad de Minnesota. El Instituto de Ciencias de la Vida de la Universidad de Michigan alberga las instalaciones HTS en el Centro de Genómica Química. La Universidad de Columbia tiene una instalación de recursos compartidos HTS con ~300.000 moléculas pequeñas diversas y ~10.000 compuestos bioactivos conocidos disponibles para detección bioquímica, basada en células y basada en NGS. La Universidad Rockefeller tiene un Centro de Recursos HTS de acceso abierto HTSRC (La Universidad Rockefeller, HTSRC), que ofrece una biblioteca de más de 380.000 compuestos. El Laboratorio de análisis de alto rendimiento de la Universidad Northwestern respalda la identificación de objetivos, la validación, el desarrollo de ensayos y la detección de compuestos. El Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, una organización sin fines de lucro, también tiene una instalación HTS de larga data en el Centro Conrad Prebys de Genómica Química, que formaba parte de MLPCN. El Scripps Research Molecular Screening Center (SRMSC) [31], una organización sin fines de lucro, continúa brindando servicios académicos en todos los institutos posteriores a la era MLPCN. Las instalaciones de SRMSC uHTS mantienen una de las colecciones de bibliotecas más grandes del mundo académico, que actualmente cuenta con más de 665 000 entidades de moléculas pequeñas, y examina de forma rutinaria la colección completa o las subbibliotecas en apoyo de iniciativas de subvenciones de PI múltiples.
En Estados Unidos, los Institutos Nacionales de Salud o NIH han creado un consorcio nacional de centros de detección de moléculas pequeñas para producir herramientas químicas innovadoras para su uso en la investigación biológica. La Red de Centros de Producción de Sondas de Bibliotecas Moleculares, o MLPCN, realiza HTS en ensayos proporcionados por la comunidad de investigación, frente a una gran biblioteca de moléculas pequeñas mantenidas en un depósito central de moléculas.