Un haploide duplicado (DH) es un genotipo que se forma cuando las células haploides se duplican cromosómicamente. La producción artificial de haploides duplicados es importante en el fitomejoramiento .
Las células haploides se producen a partir de polen u óvulos o de otras células del gametofito , luego, mediante la duplicación cromosómica inducida o espontánea, se produce una célula haploide duplicada, que puede convertirse en una planta haploide duplicada. Si la planta original era diploide , las células haploides son monoploides , y el término monoploide duplicado puede usarse para las haploides duplicadas. Los organismos haploides derivados de tetraploides o hexaploides a veces se denominan dihaploides (y los dihaploides duplicados son, respectivamente, tetraploides o hexaploides).
Los procedimientos de endogamia convencionales tardan seis generaciones en lograr una homocigosidad aproximadamente completa , mientras que la haploidía duplicada lo logra en una generación. [1] Las plantas dihaploides derivadas de cultivos tetraploides pueden ser importantes para programas de mejoramiento que involucran parientes silvestres diploides de los cultivos.
El primer informe sobre la planta haploide fue publicado por Blakeslee et al. (1922) en Datura stramonium . Posteriormente, se informaron haploides en muchas otras especies. Guha y Maheshwari (1964) desarrollaron una técnica de cultivo de anteras para la producción de haploides en el laboratorio. Se informó producción de haploides por cruce amplio en cebada (Kasha y Kao, 1970) y tabaco (Burk et al. , 1979). El tabaco, la colza y la cebada son las especies que mejor responden al doble de la producción de haploides. Actualmente se han aplicado metodologías de doble haploide a más de 250 especies. [2]
Los haploides duplicados se pueden producir in vivo o in vitro . Los embriones haploides se producen in vivo mediante partenogénesis , pseudogamia o eliminación cromosómica tras un cruce amplio. El embrión haploide se rescata, se cultiva y la duplicación de cromosomas produce haploides duplicados. Los métodos in vitro incluyen la ginogénesis ( cultivo de ovarios y flores) y la androgénesis (cultivo de anteras y microsporas). [3] La androgénesis es el método preferido. Otro método para producir haploides es el cruce amplio. En la cebada, se pueden producir haploides mediante cruce amplio con la especie relacionada Hordeum bulbosum ; la fertilización se ve afectada, pero durante las primeras etapas del desarrollo de la semilla los cromosomas de H. bulbosum se eliminan dejando un embrión haploide. En el tabaco ( Nicotiana tabacum ), se utiliza mucho el cruce amplio con Nicotiana africana . Cuando se utiliza N. africana para polinizar N. tabacum , entre el 0,25 y el 1,42 por ciento de la progenie sobrevive y puede identificarse fácilmente como híbridos F1 o haploides maternos. Aunque estos porcentajes parecen pequeños, la gran producción de semillas diminutas y la muerte temprana de la mayoría de las plántulas proporcionan un número significativo de híbridos y haploides viables en contenedores de suelo relativamente pequeños. Este método de polinización interespecífica sirve como una forma práctica de producir haploides derivados de semillas de N. tabacum , ya sea como método alternativo o complementario al cultivo de anteras.
En el método DH, solo ocurren dos tipos de genotipos para un par de alelos, A y a, con una frecuencia de ½ AA y ½ aa, mientras que en el método diploide ocurren tres genotipos con una frecuencia de ¼ AA, ½ Aa, ¼ aa. Por lo tanto, si AA es un genotipo deseable, la probabilidad de obtener este genotipo es mayor en el método haploide que en el método diploide. Si se segregan n loci, la probabilidad de obtener el genotipo deseable es (1/2)n mediante el método haploide y (1/4)n mediante el método diploide. Por tanto, la eficacia del método haploide es alta cuando el número de genes implicados es grande.
Se realizaron estudios comparando el método DH y otros métodos de reproducción convencionales y se concluyó que la adopción de la doble haploidía no conduce a ningún sesgo de genotipos en las poblaciones, e incluso se encontró que los DH aleatorios eran compatibles con la línea seleccionada producida por el método de pedigrí convencional. [4]
La mayoría de los rasgos económicos están controlados por genes con efectos pequeños pero acumulativos. Aunque el potencial de las poblaciones de DH en genética cuantitativa se conoce desde hace algún tiempo, fue la llegada de los mapas de marcadores moleculares lo que impulsó su uso en la identificación de loci que controlan los rasgos cuantitativos. Como los efectos de los loci de rasgos cuantitativos (QTL) son pequeños y están muy influenciados por factores ambientales, se necesita un fenotipado preciso con ensayos replicados. Esto es posible con organismos con doble haploidía debido a su verdadera naturaleza reproductiva y porque pueden producirse convenientemente en grandes cantidades. Utilizando poblaciones de DH, se han mapeado 130 rasgos cuantitativos en nueve especies de cultivos. [5] En total, se utilizaron 56 poblaciones de DH para la detección de QTL. [2]
En la conversión de retrocruzamiento, se introducen genes de un cultivar donante o de una especie relacionada en una línea de élite receptora mediante retrocruzamientos repetidos . Un problema en este procedimiento es poder identificar las líneas que llevan el rasgo de interés en cada generación. El problema es particularmente grave si el rasgo de interés es recesivo, ya que estará presente sólo en una condición heterocigótica después de cada retrocruzamiento. El desarrollo de marcadores moleculares proporciona un método de selección más sencillo basado en el genotipo (marcador) en lugar del fenotipo. Combinado con una haploidía duplicada, se vuelve más eficaz. En la conversión de retrocruzamiento asistida por marcadores, un progenitor receptor se cruza con una línea donante y el híbrido (F1) se retrocruza con el receptor. La generación resultante (BC1) se retrocruza y se repite el proceso hasta que se produzcan los genotipos deseados. La combinación de haploidía duplicada y marcador molecular proporciona el atajo. En la primera generación de retrocruzamiento, se puede seleccionar un genotipo con el carácter de interés y convertirlo en un genotipo homocigótico doble haploide. [6] Chen y cols. (1994) utilizaron una conversión de retrocruzamiento asistida por marcadores con haploidía duplicada de individuos BC1 para seleccionar líneas resistentes a la roya lineal en cebada.
En el análisis segregante en masa , se analiza una población para detectar un rasgo de interés y los genotipos en los dos extremos forman dos masas. Luego se analizan los dos volúmenes para determinar la presencia o ausencia de marcadores moleculares. Dado que se supone que las masas contrastan en los alelos que contribuyen a efectos positivos y negativos, cualquier polimorfismo de marcador entre las dos masas indica el vínculo entre el marcador y el rasgo de interés. BSA depende de un fenotipado preciso y la población DH tiene una ventaja particular en el sentido de que son verdaderas crías y pueden probarse repetidamente. Las poblaciones de DH se utilizan comúnmente en análisis segregantes en masa, que es un método popular en la reproducción asistida por marcadores. [7] Este método se ha aplicado principalmente a la colza y la cebada.
Los mapas genéticos son muy importantes para comprender la estructura y organización de los genomas a partir de los cuales se pueden deducir patrones de evolución y relaciones sinténicas entre especies. Los mapas genéticos también proporcionan un marco para mapear genes de interés y estimar la magnitud de sus efectos y ayudan a comprender las asociaciones de genotipo/fenotipo. Las poblaciones de DH se han convertido en recursos estándar en el mapeo genético de especies en las que los DH están fácilmente disponibles. Las poblaciones haploides duplicadas son ideales para el mapeo genético. Es posible producir un mapa genético dentro de los dos años posteriores al cruce inicial, independientemente de la especie. La construcción de mapas es relativamente fácil utilizando una población DH derivada de un híbrido de dos padres homocigotos ya que la proporción de segregación esperada es simple, es decir, 1:1. Actualmente se han utilizado poblaciones de DH para producir mapas genéticos de cebada, colza, arroz, trigo y pimienta. Las poblaciones de DH desempeñaron un papel importante al facilitar la generación de mapas de marcadores moleculares en ocho especies de cultivos. [2]
Las proporciones genéticas y las tasas de mutación se pueden leer directamente a partir de poblaciones haploides. Se utilizó una pequeña población haploide duplicada (DH) para demostrar que un gen que enana en la cebada se encuentra en el cromosoma 5H. [8] En otro estudio, se analizó la segregación de una variedad de marcadores en la cebada. [9]
Aunque el análisis QTL ha generado una gran cantidad de información sobre la ubicación de los genes y la magnitud de los efectos sobre muchos rasgos, la identificación de los genes implicados sigue siendo difícil de alcanzar. Esto se debe a una mala resolución del análisis QTL. La solución a este problema sería la producción de líneas de sustitución de cromosomas recombinantes [10] o líneas endogámicas recombinantes alineadas escalonadas. [11] Aquí, el retrocruzamiento se lleva a cabo hasta que se haya producido un nivel deseado de recombinación y se utilizan marcadores genéticos para detectar líneas de sustitución de cromosomas recombinantes deseadas en la región objetivo, que pueden fijarse mediante haploidía duplicada. [12] En el arroz, se ha descubierto que los marcadores moleculares están relacionados con los principales genes y QTL de resistencia al añublo del arroz, el tizón bacteriano y el tizón de la vaina en un mapa producido a partir de la población DH. [13]
Los métodos de reproducción tradicionales son lentos y tardan entre 10 y 15 años en desarrollarse. Otra desventaja es la ineficiencia de la selección en las primeras generaciones debido a la heterocigosidad . Estas dos desventajas pueden superarse con los DH, y se pueden evaluar y seleccionar más cruces de élite en menos tiempo.
La uniformidad es un requisito general de la línea cultivada en la mayoría de las especies, que se puede obtener fácilmente mediante la producción de DH. [14] Hay varias formas en que se pueden utilizar los DH en la producción de cultivares. Las propias líneas DH pueden liberarse como cultivares, pueden usarse como progenitores en la producción de cultivares híbridos o, más indirectamente, en la creación de líneas mejoradoras y en la conservación de germoplasma. La cebada tiene más de 100 cultivares DH directos. [6] Según la información publicada, actualmente existen alrededor de 300 cultivares derivados de DH en 12 especies en todo el mundo.
La relevancia de los DH para el fitomejoramiento ha aumentado notablemente en los últimos años debido al desarrollo de protocolos para 25 especies. [2] La haploidía duplicada ya juega un papel importante en la producción de cultivares híbridos de hortalizas, y se está examinando enérgicamente el potencial para la producción ornamental. También se están desarrollando DH en la hierba medicinal Valeriana officinalis para seleccionar líneas con alta actividad farmacológica. Otro avance interesante es que se pueden producir líneas DH homocigotas fértiles en especies que tienen sistemas de autoincompatibilidad. [15]
La capacidad de producir líneas homocigotas después de una recombinación de una sola ronda ahorra mucho tiempo a los fitomejoradores. Los estudios concluyen que los DH aleatorios son comparables a las líneas seleccionadas en la endogamia del pedigrí. [16] Las otras ventajas incluyen el desarrollo de un gran número de líneas homocigotas, análisis genético eficiente y desarrollo de marcadores de rasgos útiles en mucho menos tiempo. Beneficios más específicos incluyen la posibilidad de la propagación de semillas como alternativa a la multiplicación vegetativa en plantas ornamentales, y en especies como los árboles en los que los ciclos de vida largos y la depresión endogámica impiden los métodos de reproducción tradicionales, la haploidía duplicada ofrece nuevas alternativas.
La principal desventaja de la población DH es que la selección no se puede imponer a la población. Pero en la reproducción convencional la selección se puede practicar durante varias generaciones: de ese modo se pueden mejorar los caracteres deseables de la población.
En los haploides producidos a partir de cultivos de anteras, se observa que algunas plantas son aneuploides y otras son de tipo mixto haploide-diploide. Otra desventaja asociada con la doble haploidía es el costo que implica establecer instalaciones de cultivo y crecimiento de tejidos. El uso excesivo de la doble haploidía puede reducir la variación genética en el germoplasma genético. Por lo tanto, hay que tener en cuenta varios factores antes de implementar la doble haploidía en programas de mejoramiento.
Los avances tecnológicos ahora han proporcionado protocolos DH para la mayoría de los géneros de plantas. El número de especies susceptibles de duplicar la haploidía ha alcanzado la asombrosa cifra de 250 en tan sólo unas pocas décadas. La eficiencia de la respuesta también ha mejorado con la eliminación gradual de especies de la categoría recalcitrante. Por lo tanto, proporcionará una mayor eficiencia en el fitomejoramiento.