Un haploide doble (DH) es un genotipo que se forma cuando las células haploides experimentan una duplicación cromosómica. La producción artificial de haploides dobles es importante en el mejoramiento de plantas .
Las células haploides se producen a partir de polen , óvulos o de otras células del gametofito y, luego, por duplicación cromosómica inducida o espontánea, se produce una célula haploide duplicada, que puede convertirse en una planta haploide duplicada. Si la planta original era diploide , las células haploides son monoploides y se puede usar el término monoploide duplicada para las haploides duplicadas. Los organismos haploides derivados de tetraploides o hexaploides a veces se denominan dihaploides (y los dihaploides duplicadas son, respectivamente, tetraploides o hexaploides).
Los procedimientos de endogamia convencionales requieren seis generaciones para lograr una homocigosidad aproximadamente completa , mientras que la haploidía doble la logra en una generación. [1] Las plantas dihaploides derivadas de plantas de cultivo tetraploides pueden ser importantes para los programas de mejoramiento que involucran parientes silvestres diploides de los cultivos.
El primer informe de la planta haploide fue publicado por Blakeslee et al. (1922) en Datura stramonium . Posteriormente, se informaron haploides en muchas otras especies. Guha y Maheshwari (1964) desarrollaron una técnica de cultivo de anteras para la producción de haploides en el laboratorio. La producción de haploides por cruzamiento amplio se informó en cebada (Kasha y Kao, 1970) y tabaco (Burk et al. , 1979). El tabaco, la colza y la cebada son las especies más sensibles a la producción de haploides dobles. Las metodologías de haploides dobles se han aplicado ahora a más de 250 especies. [2]
Los haploides dobles se pueden producir in vivo o in vitro . Los embriones haploides se producen in vivo por partenogénesis , pseudogamia o eliminación de cromosomas después de un cruzamiento amplio. El embrión haploide se rescata, se cultiva y la duplicación de cromosomas produce haploides dobles. Los métodos in vitro incluyen la ginogénesis ( cultivo de ovario y flor) y la androgénesis (cultivo de anteras y microsporas). [3] La androgénesis es el método preferido. Otro método para producir haploides es el cruzamiento amplio. En la cebada, los haploides se pueden producir por cruzamiento amplio con la especie relacionada Hordeum bulbosum ; la fertilización se ve afectada, pero durante las primeras etapas del desarrollo de la semilla, los cromosomas de H. bulbosum se eliminan dejando un embrión haploide. En el tabaco ( Nicotiana tabacum ), el cruzamiento amplio con Nicotiana africana se usa ampliamente. Cuando se utiliza N. africana para polinizar N. tabacum , entre el 0,25 y el 1,42 por ciento de la progenie sobrevive y puede identificarse fácilmente como híbridos F1 o haploides maternos. Aunque estos porcentajes parecen pequeños, la gran producción de semillas diminutas y la muerte temprana de la mayoría de las plántulas proporcionan una cantidad significativa de híbridos y haploides viables en contenedores de tierra relativamente pequeños. Este método de polinización interespecífica sirve como una forma práctica de producir haploides derivados de semillas de N. tabacum , ya sea como un método alternativo o complementario al cultivo de anteras.
En el método DH sólo se dan dos tipos de genotipos para un par de alelos, A y a, con la frecuencia de ½ AA y ½ aa, mientras que en el método diploide se dan tres genotipos con la frecuencia de ¼ AA, ½ Aa, ¼ aa. Por lo tanto, si AA es el genotipo deseable, la probabilidad de obtener este genotipo es mayor en el método haploide que en el método diploide. Si n loci están segregando, la probabilidad de obtener el genotipo deseable es (1/2)n por el método haploide y (1/4)n por el método diploide. Por lo tanto, la eficiencia del método haploide es alta cuando el número de genes en cuestión es grande.
Se realizaron estudios comparando el método DH y otros métodos de crianza convencionales y se concluyó que la adopción de haploidía doble no conduce a ningún sesgo de genotipos en las poblaciones, e incluso se encontró que los DH aleatorios eran compatibles con la línea seleccionada producida por el método de pedigrí convencional. [4]
La mayoría de los caracteres económicos están controlados por genes con efectos pequeños pero acumulativos. Aunque el potencial de las poblaciones DH en la genética cuantitativa se conoce desde hace algún tiempo, fue la aparición de mapas de marcadores moleculares lo que proporcionó el impulso para su uso en la identificación de loci que controlan caracteres cuantitativos. Como los efectos de los loci de caracteres cuantitativos (QTL) son pequeños y están muy influenciados por factores ambientales, se necesita una fenotipificación precisa con ensayos replicados. Esto es posible con organismos de doble haploidía debido a su verdadera naturaleza reproductiva y porque pueden producirse convenientemente en grandes cantidades. Utilizando poblaciones DH, se han cartografiado 130 caracteres cuantitativos en nueve especies de cultivos. [5] En total, se utilizaron 56 poblaciones DH para la detección de QTL. [2]
En la conversión por retrocruzamiento, los genes se introgresan desde un cultivar donante o especies relacionadas en una línea élite receptora a través de retrocruzamiento repetido . Un problema en este procedimiento es poder identificar las líneas que portan el rasgo de interés en cada generación. El problema es particularmente agudo si el rasgo de interés es recesivo, ya que estará presente solo en una condición heterocigótica después de cada retrocruzamiento. El desarrollo de marcadores moleculares proporciona un método más fácil de selección basado en el genotipo (marcador) en lugar del fenotipo. Combinado con la haploidía doble, se vuelve más efectivo. En la conversión por retrocruzamiento asistida por marcadores, un progenitor receptor se cruza con una línea donante y el híbrido (F1) se retrocruza con el receptor. La generación resultante (BC1) se retrocruza y el proceso se repite hasta que se producen los genotipos deseados. La combinación de haploidía doble y marcador molecular proporciona el atajo. En la generación de retrocruzamiento en sí, se puede seleccionar un genotipo con el carácter de interés y convertirlo en un genotipo doblemente haploide homocigótico. [6] Chen et al. (1994) utilizaron la conversión de retrocruzamiento asistida por marcadores con doble haploidía de individuos BC1 para seleccionar líneas resistentes a la roya estriada en la cebada.
En el análisis segregante en bloque , se examina una población en busca de un rasgo de interés y los genotipos en los dos extremos forman dos bloques. Luego, se prueban los dos bloques para detectar la presencia o ausencia de marcadores moleculares. Dado que se supone que los bloques contrastan en los alelos que contribuyen con efectos positivos y negativos, cualquier polimorfismo de marcador entre los dos bloques indica el vínculo entre el marcador y el rasgo de interés. El análisis segregante en bloque depende de una fenotipificación precisa y la población DH tiene una ventaja particular en el sentido de que es una raza verdadera y se puede probar repetidamente. Las poblaciones DH se utilizan comúnmente en el análisis segregante en bloque, que es un método popular en la cría asistida por marcadores. [7] Este método se ha aplicado principalmente a la colza y la cebada.
Los mapas genéticos son muy importantes para comprender la estructura y organización de los genomas a partir de los cuales se pueden deducir patrones de evolución y relaciones sinténicas entre especies. Los mapas genéticos también proporcionan un marco para el mapeo de genes de interés y la estimación de la magnitud de sus efectos y ayudan a nuestra comprensión de las asociaciones genotipo/fenotipo. Las poblaciones DH se han convertido en recursos estándar en el mapeo genético para especies en las que los DH están fácilmente disponibles. Las poblaciones doblemente haploides son ideales para el mapeo genético. Es posible producir un mapa genético dentro de los dos años del cruce inicial independientemente de la especie. La construcción de mapas es relativamente fácil utilizando una población DH derivada de un híbrido de dos progenitores homocigotos ya que la relación de segregación esperada es simple, es decir , 1:1. Las poblaciones DH ahora se han utilizado para producir mapas genéticos de cebada, colza, arroz, trigo y pimienta. Las poblaciones DH desempeñaron un papel importante en facilitar la generación de mapas de marcadores moleculares en ocho especies de cultivos. [2]
Las proporciones genéticas y las tasas de mutación se pueden leer directamente a partir de poblaciones haploides. Se utilizó una pequeña población haploide doble (DH) para demostrar que un gen de enanismo en la cebada se encuentra en el cromosoma 5H. [8] En otro estudio se analizó la segregación de una serie de marcadores en la cebada. [9]
Aunque el análisis de QTL ha generado una gran cantidad de información sobre las ubicaciones de los genes y la magnitud de los efectos en muchos rasgos, la identificación de los genes involucrados ha seguido siendo difícil de alcanzar. Esto se debe a la baja resolución del análisis de QTL. La solución para este problema sería la producción de una línea de sustitución cromosómica recombinante [10] o líneas endogámicas recombinantes alineadas por pasos [11] . Aquí, se lleva a cabo un retrocruzamiento hasta que se haya producido un nivel deseado de recombinación y se utilizan marcadores genéticos para detectar las líneas de sustitución cromosómica recombinante deseadas en la región objetivo, que se puede fijar mediante haploidía doble [12] . En el arroz, se ha descubierto que los marcadores moleculares están vinculados con los principales genes y QTL de resistencia al tizón del arroz, al tizón bacteriano y al tizón de la vaina en un mapa producido a partir de la población DH [13] .
Los métodos de mejoramiento tradicionales son lentos y requieren de 10 a 15 años para el desarrollo de un cultivar. Otra desventaja es la ineficiencia de la selección en las primeras generaciones debido a la heterocigosidad . Estas dos desventajas se pueden superar con cruces DH y se pueden evaluar y seleccionar más cruces de élite en menos tiempo.
La uniformidad es un requisito general de las líneas cultivadas en la mayoría de las especies, que se puede obtener fácilmente mediante la producción de DH. [14] Existen varias formas en las que se pueden utilizar DH en la producción de cultivares. Las propias líneas DH se pueden liberar como cultivares, se pueden utilizar como progenitores en la producción de cultivares híbridos o de forma más indirecta en la creación de líneas de mejoradores y en la conservación de germoplasma. La cebada tiene más de 100 cultivares DH directos. [6] Según la información publicada, actualmente hay alrededor de 300 cultivares derivados de DH en 12 especies en todo el mundo.
La relevancia de las DH para el mejoramiento de plantas ha aumentado notablemente en los últimos años debido al desarrollo de protocolos para 25 especies. [2] La doble haploidía ya desempeña un papel importante en la producción de cultivares híbridos de hortalizas, y se está estudiando enérgicamente el potencial para la producción ornamental. También se están desarrollando DH en la hierba medicinal Valeriana officinalis para seleccionar líneas con alta actividad farmacológica. Otro desarrollo interesante es que se pueden producir líneas DH homocigóticas fértiles en especies que tienen sistemas de autoincompatibilidad. [15]
La capacidad de producir líneas homocigóticas después de una sola ronda de recombinación ahorra mucho tiempo a los fitomejoradores. Los estudios concluyen que las DH aleatorias son comparables a las líneas seleccionadas en la endogamia de pedigrí. [16] Las otras ventajas incluyen el desarrollo de un gran número de líneas homocigóticas, un análisis genético eficiente y el desarrollo de marcadores para rasgos útiles en mucho menos tiempo. Los beneficios más específicos incluyen la posibilidad de propagación de semillas como una alternativa a la multiplicación vegetativa en plantas ornamentales, y en especies como los árboles en los que los ciclos de vida largos y la depresión endogámica impiden los métodos de mejoramiento tradicionales, la haploidía doble proporciona nuevas alternativas.
La principal desventaja de la población DH es que la selección no se puede imponer a la población, pero en la crianza convencional la selección se puede practicar durante varias generaciones: de esta manera se pueden mejorar caracteres deseables en la población.
En los haploides producidos a partir de cultivos de anteras, se observa que algunas plantas son aneuploides y otras son de tipo mixto haploide-diploide. Otra desventaja asociada con la doble haploidía es el costo que implica establecer instalaciones de cultivo de tejidos y de crecimiento. El uso excesivo de la doble haploidía puede reducir la variación genética en el germoplasma de mejoramiento. Por lo tanto, hay que tener en cuenta varios factores antes de implementar la doble haploidía en los programas de mejoramiento.
Los avances tecnológicos han proporcionado protocolos de haploidía dual para la mayoría de los géneros de plantas. El número de especies que pueden ser sometidas a doble haploidía ha alcanzado la asombrosa cifra de 250 en tan solo unas décadas. La eficiencia de la respuesta también ha mejorado con la eliminación gradual de especies de la categoría de recalcitrantes, lo que proporcionará una mayor eficiencia en el mejoramiento de plantas.