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Inserción de genes

En la clonación molecular y la biología , un gen knock-in (abreviatura: KI ) se refiere a un método de ingeniería genética que implica la sustitución uno por uno de la información de la secuencia de ADN en un locus genético o la inserción de información de secuencia que no se encuentra dentro del locus. [1] Por lo general, esto se hace en ratones, ya que la tecnología para este proceso es más refinada y existe un alto grado de complejidad de secuencia compartida entre ratones y humanos. [2] La diferencia entre la tecnología knock-in y las técnicas transgénicas tradicionales es que un knock-in implica un gen insertado en un locus específico y, por lo tanto, es una inserción "dirigida". Es lo opuesto al knockout genético .

Un uso común de la tecnología knock-in es la creación de modelos de enfermedades. Es una técnica mediante la cual los investigadores científicos pueden estudiar la función de la maquinaria reguladora (por ejemplo, los promotores ) que gobierna la expresión del gen natural que se está reemplazando. Esto se logra observando el nuevo fenotipo del organismo en cuestión. Los BAC y los YAC se utilizan en este caso para poder transferir fragmentos grandes.

Técnica

La técnica de knock-in de genes se originó como una ligera modificación de la técnica original de knock-out desarrollada por Martin Evans , Oliver Smithies y Mario Capecchi . Tradicionalmente, las técnicas de knock-in se han basado en la recombinación homóloga para impulsar el reemplazo de genes específicos, aunque se han desarrollado otros métodos que utilizan un sistema mediado por transposones para insertar el gen objetivo. [3] El uso de sitios flanqueantes de loxP que se extirpan tras la expresión de la recombinasa Cre con vectores genéticos es un ejemplo de esto. Las células madre embrionarias con la modificación de interés se implantan luego en un blastocisto viable , que crecerá hasta convertirse en un ratón quimérico maduro con algunas células que tienen la información genética de la célula del blastocisto original y otras células que tienen las modificaciones introducidas en las células madre embrionarias. La descendencia posterior del ratón quimérico tendrá entonces el gen knock-in. [4]

La técnica de knock-in ha permitido, por primera vez, realizar estudios basados ​​en hipótesis sobre modificaciones genéticas y fenotipos resultantes. Por ejemplo, las mutaciones en el gen p53 humano pueden ser inducidas por la exposición al benzo(a)pireno (BaP) y la copia mutada del gen p53 puede ser insertada en genomas de ratones. Los tumores pulmonares observados en los ratones knock-in respaldan la hipótesis de la carcinogenicidad del BaP . [5] Los avances más recientes en la técnica de knock-in han permitido insertar en cerdos un gen para la proteína fluorescente verde con un sistema CRISPR/Cas9 , lo que permite inserciones genéticas mucho más precisas y exitosas. [6] La velocidad de la técnica de knock-in mediada por CRISPR/Cas9 también permite generar modificaciones bialélicas en algunos genes y observar el fenotipo en ratones en una sola generación, un período de tiempo sin precedentes. [7]

Contra el gen knockout

La tecnología de inserción de genes se diferencia de la tecnología de eliminación en que la tecnología de eliminación tiene como objetivo eliminar parte de la secuencia de ADN o insertar información irrelevante de la secuencia de ADN para interrumpir la expresión de un locus genético específico. La tecnología de inserción de genes, por otro lado, altera el locus genético de interés mediante una sustitución uno por uno de la información de la secuencia de ADN o mediante la adición de información de la secuencia que no se encuentra en dicho locus genético. Por lo tanto, una inserción de genes puede considerarse una mutación de ganancia de función y una eliminación de genes una mutación de pérdida de función , pero una inserción de genes también puede implicar la sustitución de un locus genético funcional por un fenotipo mutante que da como resultado alguna pérdida de función. [8]

Aplicaciones potenciales

Debido al éxito de los métodos de knock-in de genes hasta el momento, se pueden vislumbrar muchas aplicaciones clínicas. Ya se ha demostrado que la inserción de secciones del gen de inmunoglobulina humana en ratones les permite producir anticuerpos humanizados que son terapéuticamente útiles. [9] Debería ser posible modificar células madre en humanos para restaurar la función de genes específicos en ciertos tejidos, por ejemplo, posiblemente corrigiendo el gen mutante de la cadena gamma del receptor de IL-2 en células madre hematopoyéticas para restaurar el desarrollo de linfocitos en personas con inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X. [4]

Limitaciones

Aunque la tecnología de inserción de genes ha demostrado ser una técnica poderosa para la generación de modelos de enfermedades humanas y el conocimiento de las proteínas in vivo , aún existen numerosas limitaciones. Muchas de ellas son compartidas con las limitaciones de la tecnología de inserción. En primer lugar, las combinaciones de genes de inserción conducen a una creciente complejidad en las interacciones que los genes insertados y sus productos tienen con otras secciones del genoma y, por lo tanto, pueden conducir a más efectos secundarios y fenotipos difíciles de explicar . Además, solo unos pocos loci, como el locus ROSA26, se han caracterizado lo suficientemente bien como para poder usarlos para la inserción condicional de genes, lo que hace que las combinaciones de genes reporteros y transgenes en el mismo locus sean problemáticas. La mayor desventaja de usar la inserción de genes para la generación de modelos de enfermedades humanas es que la fisiología del ratón no es idéntica a la de los humanos y los ortólogos humanos de las proteínas expresadas en ratones a menudo no reflejarán completamente el papel de un gen en la patología humana. [10] Esto se puede observar en ratones producidos con la mutación de fibrosis ΔF508 en el gen CFTR , que representa más del 70% de las mutaciones en este gen para la población humana y conduce a la fibrosis quística . Si bien los ratones CF ΔF508 exhiben los defectos de procesamiento característicos de la mutación humana, no muestran los cambios patofisiológicos pulmonares observados en humanos y prácticamente no tienen fenotipo pulmonar. [11] Estos problemas podrían mejorarse mediante el uso de una variedad de modelos animales, y se han generado modelos porcinos (los pulmones de cerdo comparten muchas similitudes bioquímicas y fisiológicas con los pulmones humanos) en un intento de explicar mejor la actividad de la mutación ΔF508. [12]

Véase también

Referencias

  1. ^ Gibson, Greg (2009). Introducción a la ciencia del genoma, 3.ª edición . Sunderland, Massachusetts: Sinauer. pp. 301–302. ISBN 978-0-87893-236-8.
  2. ^ Consorcio de secuenciación del genoma del ratón; Waterston, Robert H.; Lindblad-Toh, Kerstin; Birney, Ewan; Rogers, Jane; Abril, Josep F.; Agarwal, Pankaj; Agarwala, Richa; Ainscough, Rachel (5 de diciembre de 2002). "Secuenciación inicial y análisis comparativo del genoma del ratón". Nature . 420 (6915): 520–562. Bibcode :2002Natur.420..520W. doi : 10.1038/nature01262 . ISSN  0028-0836. PMID  12466850.
  3. ^ Westphal, CH; Leder, P. (1 de julio de 1997). "Construcciones de genes 'knock-out' y 'knock-in' generadas por transposón para su uso en ratones". Current Biology . 7 (7): 530–533. doi : 10.1016/s0960-9822(06)00224-7 . ISSN  0960-9822. PMID  9210379.
  4. ^ ab Manis, John P. (13 de diciembre de 2007). "Knock out, knock in, knock down: ratones genéticamente manipulados y el Premio Nobel". The New England Journal of Medicine . 357 (24): 2426–2429. doi :10.1056/NEJMp0707712. ISSN  1533-4406. PMID  18077807.
  5. ^ Liu, Zhipei; Muehlbauer, Karl-Rudolf; Schmeiser, Heinz H.; Hergenhahn, Manfred; Belharazem, Djeda; Hollstein, Monica C. (1 de abril de 2005). "Las mutaciones de p53 en fibroblastos murinos humanos con p53 knock-in expuestos a benzo(a)pireno se correlacionan con mutaciones de p53 en tumores pulmonares humanos". Cancer Research . 65 (7): 2583–2587. doi :10.1158/0008-5472.CAN-04-3675. ISSN  0008-5472. PMID  15805253.
  6. ^ Ruan, Jinxue; Li, Hegang; Xu, Kui; Wu, Tianwen; Wei, Jingliang; Zhou, Rong; Liu, Zhiguo; Mu, Yulian; Yang, Shulin (18 de septiembre de 2015). "Knockin transgén mediado por CRISPR/Cas9 altamente eficiente en el locus H11 en cerdos". Informes científicos . 5 : 14253. Código Bib : 2015NatSR...514253R. doi :10.1038/srep14253. PMC 4585612 . PMID  26381350. 
  7. ^ Wang, Yanliang; Li, Junhong; Xiang, Jinzhu; Wen, Bingqiang; Mu, Haiyuan; Zhang, Wei; Han, Jianyong (10 de diciembre de 2015). "Generación altamente eficiente de ratones con genes indicadores bialélicos mediante la edición del genoma de ESC mediada por CRISPR". Proteína y célula . 7 (2): 152-156. doi :10.1007/s13238-015-0228-3. ISSN  1674-800X. PMC 4742388 . PMID  26661644. 
  8. ^ Doyle, Alfred; McGarry, Michael P.; Lee, Nancy A.; Lee, James J. (1 de abril de 2012). "La construcción de modelos de ratones transgénicos y de genes knockout/knockin de enfermedades humanas". Investigación transgénica . 21 (2): 327–349. doi :10.1007/s11248-011-9537-3. ISSN  0962-8819. PMC 3516403 . PMID  21800101. 
  9. ^ Benatuil, Lorenzo; Kaye, Joel; Cretin, Nathalie; Godwin, Jonathan G.; Cariappa, Annaiah; Pillai, Shiv; Iacomini, John (15 de marzo de 2008). "Ratones knock-in con Ig que producen anticuerpos anticarbohidratos: avance de las células B que producen anticuerpos anti-propios de baja afinidad". Journal of Immunology . 180 (6): 3839–3848. doi : 10.4049/jimmunol.180.6.3839 . ISSN  0022-1767. PMID  18322191.
  10. ^ Tellkamp, ​​Frederik; Benhadou, Farida; Bremer, Jeroen; Gnarra, Maria; Knüver, Jana; Schaffenrath, Sandra; Vorhagen, Susanne (1 de diciembre de 2014). "Tecnología de ratones transgénicos en biología de la piel: generación de ratones knockin". The Journal of Investigative Dermatology . 134 (12): 1–3. doi : 10.1038/jid.2014.434 . ISSN  1523-1747. PMID  25381772.
  11. ^ Grubb, Barbara R.; Boucher, Richard C. (1 de enero de 1999). "Fisiopatología de modelos de ratones con genes específicos para la fibrosis quística". Physiological Reviews . 79 (1): S193–S214. doi :10.1152/physrev.1999.79.1.S193. ISSN  0031-9333. PMID  9922382.
  12. ^ Rogers, Christopher S.; Hao, Yanhong; Rokhlina, Tatiana; Samuel, Melissa; Stoltz, David A.; Li, Yuhong; Petroff, Elena; Vermeer, Daniel W.; Kabel, Amanda C. (1 de abril de 2008). "Producción de cerdos heterocigotos CFTR-null y CFTR-DeltaF508 mediante la selección de genes mediada por virus adenoasociados y la transferencia nuclear de células somáticas". The Journal of Clinical Investigation . 118 (4): 1571–1577. doi :10.1172/JCI34773. ISSN  0021-9738. PMC 2265103 . PMID  18324337. 

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