Una etiqueta de polihistidina , más conocida por el nombre de marca registrada His-tag , es un motivo de aminoácidos en las proteínas que normalmente consta de al menos seis residuos de histidina ( His ), a menudo en el extremo N o C de la proteína. También se conoce como etiqueta de hexa histidina , etiqueta 6xHis o etiqueta His6 . La etiqueta fue inventada por Roche , [1] aunque el uso de histidinas y sus vectores son distribuidos por Qiagen . Varios kits de purificación para proteínas marcadas con histidina están disponibles comercialmente de varias empresas. [2]
El número total de residuos de histidina puede variar en la etiqueta desde tan solo dos hasta tan alto como 10 o más residuos de His. Las etiquetas His N- o C-terminales también pueden ser seguidas o precedidas, respectivamente, por una secuencia de aminoácidos adecuada que facilite la eliminación de la etiqueta de polihistidina usando endopeptidasas . Esta secuencia adicional no es necesaria si se usan exopeptidasas para eliminar las etiquetas His N-terminales (p. ej., Qiagen TAGZyme). Además, la escisión por exopeptidasa puede resolver la escisión inespecífica observada cuando se usa la eliminación de etiquetas basada en endoproteasas. Las etiquetas de polihistidina se usan a menudo para la purificación por afinidad de proteínas modificadas genéticamente .
(aq)23views.png/1280px-Ni(NTA)(aq)23views.png)
Las proteínas pueden coordinar iones metálicos en su superficie y es posible separar proteínas mediante cromatografía haciendo uso de la diferencia en su afinidad a los iones metálicos. Esto se denomina cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC), como se introdujo originalmente en 1975 bajo el nombre de cromatografía de afinidad de quelatos metálicos. [3] Estudios posteriores han revelado que entre los aminoácidos que constituyen las proteínas, la histidina está fuertemente involucrada en el complejo de coordinación con iones metálicos. [4] Por lo tanto, si se agrega una cantidad de histidinas al final de la proteína, la afinidad de la proteína por el ion metálico aumenta y esto se puede aprovechar para aislar selectivamente la proteína de interés. Cuando una proteína con una etiqueta His se pone en contacto con un portador en el que está inmovilizado un ion metálico como el níquel, el residuo de histidina quela el ion metálico y se une al portador. Dado que otras proteínas no se unen al transportador o lo hacen de forma muy débil, se pueden eliminar lavando el transportador con un tampón adecuado. La proteína marcada con polihistidina se puede recuperar eluyéndola de la resina. [5]
Las etiquetas de polihistidina constan más comúnmente de seis residuos de histidina. Sin embargo, las etiquetas con hasta doce residuos de histidina o etiquetas duales unidas mediante un enlace corto no son infrecuentes y pueden mejorar los resultados de purificación al mejorar la unión a la resina de afinidad, lo que permite una mayor rigurosidad del lavado y la separación de las proteínas endógenas. [6] [7] [8] La etiqueta se puede agregar a un gen de interés utilizando métodos comunes a la mayoría de las etiquetas de purificación . El método más básico es subclonar el gen de interés en un vector que contenga una secuencia de etiqueta de polihistidina. Muchos vectores para usar con varios sistemas de expresión están disponibles con etiquetas de polihistidina en una variedad de posiciones y con diferentes sitios de escisión de proteasas, otras etiquetas , etc. [9] Sin embargo, si no hay un vector apropiado disponible o la etiqueta debe insertarse en una ubicación distinta a los extremos N o C de las proteínas, el gen de interés puede sintetizarse directamente conteniendo una secuencia de etiqueta de polihistidina o se pueden usar varios métodos basados en PCR para agregar la etiqueta a un gen. Un enfoque común es agregar la secuencia codificante para la etiqueta de polihistidina a los cebadores de PCR como un saliente. [10] [11]
Lo más común es que una etiqueta de polihistidina se fusione en el extremo N o C de una proteína y se una a través de un conector corto y flexible, que puede contener un sitio de escisión de proteasa. [10] [9] Con menos frecuencia, las etiquetas se pueden agregar tanto en el extremo N como en el C o insertar en una parte intermedia de una proteína, como dentro de un bucle expuesto. [12] [8] La elección de la posición de la etiqueta depende de las propiedades de cada proteína y de la estrategia de purificación elegida; puede ser necesario probar múltiples construcciones con la etiqueta en diferentes posiciones. [6] [10] Aunque se considera que las etiquetas de polihistidina normalmente no alteran las propiedades de una proteína, se ha demostrado que la adición de la etiqueta puede causar efectos no deseados, como influir en el estado oligomérico de la proteína. [13]
Existen en el mercado diversas matrices de soporte unidas a un soporte de resina sólida que pueden cargarse posteriormente con un catión metálico. Los derivados del ácido iminodiacético (IDA) y del ácido nitrilotriacético (NTA) son los más utilizados para este fin, y cada una de ellas presenta ciertas ventajas y desventajas para diversas aplicaciones. [14]
Varios cationes metálicos tienen una alta afinidad por el imidazol, el grupo funcional de la etiqueta His. Los complejos de imidazol de metales de transición con cationes divalentes M2 + (M = Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zi , etc. ) son los más utilizados para este propósito. La elección del catión es generalmente un compromiso entre la capacidad de unión y la pureza. El níquel se utiliza a menudo ya que ofrece un buen equilibrio entre estos factores, mientras que el cobalto se puede utilizar cuando se desea aumentar la pureza de la purificación ya que tiene menos afinidad por las proteínas endógenas; sin embargo, la capacidad de unión es menor en comparación con el níquel. [14] [10]
Para eluir la proteína marcada con His del transportador, existen varios métodos posibles que pueden utilizarse en combinación si es necesario. Para evitar la desnaturalización de las proteínas, generalmente es deseable utilizar un método lo más suave posible.
Para liberar la proteína marcada con His del transportador, se utiliza un compuesto que tiene una estructura similar a la etiqueta de His y que también forma un complejo de coordinación con los iones metálicos inmovilizados. Un compuesto de este tipo añadido a la proteína marcada con His en el transportador compite con la proteína por los iones metálicos inmovilizados. El compuesto añadido en alta concentración reemplaza prácticamente toda la proteína unida al transportador que, de este modo, se eluye del transportador. El imidazol es la cadena lateral de la histidina y se utiliza normalmente en una concentración de 150 a 500 mM para la elución. También se puede utilizar histidina o histamina.
Cuando el pH disminuye, el residuo de histidina se protona y ya no puede coordinarse con la etiqueta metálica, lo que permite la elución de la proteína. Cuando se utiliza níquel como ion metálico, se eluye a un pH de alrededor de 4 y cobalto a un pH de alrededor de 6.
Cuando se agrega un agente quelante fuerte como EDTA, la proteína se separa del portador porque se pierde el ion metálico inmovilizado en el portador.
Las etiquetas de polihistidina se utilizan a menudo para la purificación por afinidad de proteínas recombinantes etiquetadas con polihistidina expresadas en Escherichia coli u otros sistemas de expresión. Normalmente, las células se recolectan mediante centrifugación y el sedimento celular resultante se lisa por medios físicos o por medio de detergentes y enzimas como la lisozima o cualquier combinación de estos. En esta etapa, el lisado contiene la proteína recombinante entre muchas proteínas endógenas que se originan de las células huésped. El lisado se expone a una resina de afinidad unida a una matriz portadora acoplada con un catión divalente, ya sea por adición directa de resina (unión por lotes) o pasando sobre un lecho de resina en un formato de columna. Luego, la resina se lava con un tampón para eliminar las proteínas que no interactúan específicamente con el catión unido y la proteína de interés se eluye de la resina utilizando un tampón que contiene una alta concentración de imidazol o un pH reducido. La pureza y la cantidad de proteína se pueden evaluar mediante métodos como SDS-PAGE y Western blotting . [14] [10] [15]
La purificación por afinidad utilizando una etiqueta de polihistidina generalmente da como resultado una proteína relativamente pura. La pureza de la proteína se puede mejorar mediante la adición de una concentración baja (20-40 mM) de imidazol a los tampones de unión y/o lavado. Sin embargo, dependiendo de los requisitos de la aplicación posterior, pueden requerirse pasos de purificación adicionales utilizando métodos como intercambio iónico o cromatografía de exclusión por tamaño . Las resinas IMAC generalmente retienen varias proteínas endógenas prominentes como impurezas. En E. coli , por ejemplo, un ejemplo destacado es la peptidil prolil isomerasa de tipo FKBP, que aparece alrededor de 25 kDa en SDS-PAGE . Estas impurezas se pueden eliminar utilizando pasos de purificación adicionales o expresando la proteína recombinante en una cepa deficiente de células. Alternativamente, se pueden utilizar resinas IMAC cargadas con cobalto que tienen menos afinidad por las proteínas endógenas. [16] [10] [14] [17]
El marcado con polihistidina se puede utilizar para detectar interacciones proteína-proteína de la misma manera que un ensayo de pull-down . El marcado con polihistidina tiene varias ventajas sobre otros marcadores que se utilizan habitualmente para ensayos de pull-down, entre ellas su pequeño tamaño, la escasa cantidad de proteínas naturales que se unen a las matrices portadoras y la mayor estabilidad de la matriz portadora en comparación con las matrices de anticuerpos monoclonales. [18]
Se han desarrollado etiquetas CyDye de hexahistadina, que utilizan la coordinación covalente de níquel con grupos EDTA unidos a fluoróforos para crear colorantes que se adhieren a la etiqueta de polihistidina. Se ha demostrado que esta técnica es útil para seguir la migración y el tráfico de proteínas y puede ser eficaz para medir la distancia mediante la transferencia de energía por resonancia de Förster . [19]
Se ha informado sobre el uso de una etiqueta de polifluorohistidina en sistemas de traducción in vitro . [20] En este sistema, se utiliza un código genético expandido en el que la histidina se reemplaza por 4-fluorohistidina. El análogo fluorado se incorpora a los péptidos a través de la especificidad de sustrato relajada de la histidina-ARNt ligasa y reduce el pK a general de la etiqueta. Esto permite el enriquecimiento selectivo de péptidos etiquetados con polifluorohistidina en presencia de mezclas complejas de etiquetas de polihistidina tradicionales alterando el pH de los tampones de lavado. [ cita requerida ]
La etiqueta de polihistidina también se puede utilizar para detectar una proteína mediante anticuerpos anti-etiqueta de polihistidina , que pueden ser útiles para la localización subcelular , ELISA , transferencia Western y otros métodos inmunoanalíticos. Alternativamente, la tinción en gel de geles SDS-PAGE o PAGE nativos con sondas fluorescentes que portan iones metálicos se puede utilizar para la detección de una proteína marcada con polihistidina. [21]
La etiqueta HQ tiene histidina y glutamina alternadas (HQHQHQ).
La etiqueta HN tiene histidina y asparagina alternadas (HNHNHNHNHNHN) y es más probable que se presente en la superficie de la proteína que las etiquetas que contienen solo histidina. La etiqueta HN se une al ion metálico inmovilizado de manera más eficiente que la etiqueta His. [22]
La etiqueta HAT es una etiqueta peptídica (KDHLIHNVHKEEHAHAHNK) derivada de la lactato deshidrogenasa de pollo , y es más probable que sea una proteína soluble sin sesgo en la distribución de carga en comparación con la etiqueta His. [23] La disposición de las histidinas en la etiqueta HAT permite una alta accesibilidad en comparación con la etiqueta His, y se une de manera eficiente al ion metálico inmovilizado.
{{cite web}}: CS1 maint: bot: estado de URL original desconocido ( enlace )