La N -etilmaleimida ( NEM ) es un compuesto orgánico derivado del ácido maleico . Contiene el grupo funcional amida , pero lo más importante es que es un alqueno que reacciona con los tioles y se utiliza comúnmente para modificar los residuos de cisteína en proteínas y péptidos . [2]
El NEM es un aceptor de Michael en la reacción de Michael , lo que significa que agrega nucleófilos como los tioles. El tioéter resultante presenta un fuerte enlace CS y la reacción es virtualmente irreversible. La reacción con tioles ocurre en el rango de pH de 6,5 a 7,5, el NEM puede reaccionar con aminas o sufrir hidrólisis a un pH más alcalino. El NEM se ha utilizado ampliamente para investigar el papel funcional de los grupos tiol en enzimología . El NEM es un inhibidor irreversible de todas las cisteína peptidasas , y la alquilación ocurre en el grupo tiol del sitio activo (ver esquema). [3] [4]
La NEM bloquea el transporte vesicular . En los tampones de lisis, se utilizan de 20 a 25 mM de NEM para inhibir la des- sumoilación de proteínas para el análisis Western Blot . La NEM también se ha utilizado como inhibidor de las desubiquitinasas.
Arthur Kornberg y sus colegas utilizaron la N -etilmaleimida para inactivar la ADN polimerasa III y comparar su actividad con la de la ADN polimerasa I (pol III y I, respectivamente). Kornberg había recibido el Premio Nobel por descubrir la pol I, que entonces se creía que era el mecanismo de replicación del ADN bacteriano , aunque en este experimento demostró que la pol III era la verdadera maquinaria replicativa.
La NEM activa el eflujo de K dependiente de Cl insensible a la ouabaína en glóbulos rojos de ovejas y cabras con bajo contenido de K. [5] Este descubrimiento contribuyó a la identificación molecular del cotransportador K-Cl (KCC) en células embrionarias humanas transfectadas por ADNc de la isoforma KCC1, 16 años después. [6] Desde entonces, la NEM se ha utilizado ampliamente como herramienta de diagnóstico para descubrir o manipular la presencia de cotransportador K-Cl en la membrana de células de muchas especies del reino animal. [7] A pesar de los repetidos intentos fallidos de identificar químicamente el grupo tiol objetivo, [8] a pH fisiológico, la NEM puede formar aductos con tioles dentro de las quinasas proteínicas que fosforilan el KCC en residuos de serina y treonina específicos principalmente dentro del dominio C-terminal del transportador. [9] La desfosforilación resultante del KCC por las fosfatasas proteínicas conduce a la activación del KCC. [10]