En un análisis químico , el método del estándar interno implica agregar la misma cantidad de una sustancia química a cada muestra y solución de calibración . El estándar interno responde proporcionalmente a los cambios en el analito y proporciona una señal de medición similar, pero no idéntica. También debe estar ausente de la matriz de muestra para garantizar que no haya otra fuente del estándar interno presente. Tomar la relación entre la señal del analito y la señal del estándar interno y representarla frente a las concentraciones del analito en las soluciones de calibración dará como resultado una curva de calibración . Luego, la curva de calibración se puede utilizar para calcular la concentración del analito en una muestra desconocida. [1]
La selección de un estándar interno apropiado tiene en cuenta las fuentes aleatorias y sistemáticas de incertidumbre que surgen durante la preparación de la muestra o la fluctuación del instrumento. Esto se debe a que la proporción de analito con respecto a la cantidad de patrón interno es independiente de estas variaciones. Si el valor medido del analito se desplaza erróneamente por encima o por debajo del valor real, las mediciones del estándar interno deberían desplazarse en la misma dirección. [1]
El gráfico de relación proporciona una buena manera de compensar la variación de la sensibilidad del detector, pero puede estar sesgado y debe reemplazarse por cálculos de concentración relativa/calibración relativa si el motivo de la variabilidad de la respuesta es una masa diferente de la muestra analizada y la curva de calibración tradicional (no estándar interna) de cualquier analito no es lineal en su origen. [2]
El primer uso registrado del método del estándar interno se remonta al trabajo de espectroscopia de llama de Gouy en 1877, donde utilizó un estándar interno para determinar si la excitación en su llama era consistente. [3] [4] Su procedimiento experimental se reintrodujo más tarde en la década de 1940, cuando los fotómetros de llama registradores estuvieron disponibles. [3] El uso de estándares internos continuó creciendo, aplicándose a una amplia gama de técnicas analíticas, incluida la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) , la cromatografía y la espectroscopia de plasma acoplado inductivamente .
En la espectroscopía de RMN, por ejemplo de los núcleos 1 H, 13 C y 29 Si, las frecuencias dependen del campo magnético, que no es el mismo en todos los experimentos. Por lo tanto, las frecuencias se informan como diferencias relativas al tetrametilsilano (TMS), un estándar interno que George Tiers propuso en 1958 y que desde entonces ha respaldado la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada . [5] [6] La diferencia relativa con TMS se llama cambio químico . [7]
TMS funciona como un estándar ideal porque es relativamente inerte y sus protones metílicos idénticos producen una fuerte señal en el campo superior, aislada de la mayoría de los demás protones. [7] Es soluble en la mayoría de los disolventes orgánicos y se puede eliminar mediante destilación debido a su bajo punto de ebullición. [1]
En la práctica, se conoce la diferencia entre las señales de los disolventes comunes y las del TMS. Por lo tanto, no es necesario agregar TMS a los solventes deuterados comerciales , ya que los instrumentos modernos son capaces de detectar pequeñas cantidades de solvente protonado presente. Al especificar el disolvente de bloqueo que se utilizará, los espectrómetros modernos pueden referenciar correctamente la muestra; de hecho, el propio disolvente sirve como patrón interno. [1]
En cromatografía, los estándares internos se utilizan para determinar la concentración de otros analitos mediante el cálculo del factor de respuesta . El estándar interno seleccionado debe tener un tiempo de retención y derivatización similar . Debe ser estable y no interferir con los componentes de la muestra. Esto mitiga la incertidumbre que puede ocurrir en los pasos preparatorios, como la inyección de muestras. [1]
En la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), los compuestos deuterados con estructuras similares a las del analito suelen actuar como estándares internos eficaces. [8] Sin embargo, existen estándares internos no deuterados como la norleucina , que es popular en el análisis de aminoácidos porque puede separarse de los picos que lo acompañan. [9] [10] [11]
La selección de un estándar interno para cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) depende del método de ionización empleado. El estándar interno necesita una respuesta de ionización y un patrón de fragmentación comparables a los del analito. [12] Los estándares internos de LC-MS suelen ser isotópicamente análogos a la estructura del analito, utilizando isótopos como el deuterio ( 2 H), 13 C, 15 N y 18 O. [13]
Seleccionar un estándar interno en espectroscopia de plasma acoplado inductivamente puede resultar difícil, porque las señales de la matriz de la muestra pueden superponerse con las que pertenecen al analito. El itrio es un estándar interno común que naturalmente está ausente en la mayoría de las muestras. Tiene una masa de rango medio y líneas de emisión que no interfieren con muchos analitos. La intensidad de la señal de itrio es con lo que se compara la señal del analito. [1] [14]
En la espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), las especies con una masa similar a la del analito suelen servir como buenos estándares internos, aunque no en todos los casos. Los factores que también contribuyen a la eficacia de un estándar interno en ICP-MS incluyen qué tan cerca están su potencial de ionización , el cambio de entalpía y el cambio de entropía del analito. [15]
Los estándares internos de espectroscopía de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) se pueden seleccionar observando cómo cambian las señales del analito y del estándar interno con diferentes condiciones experimentales. Esto incluye realizar ajustes en la matriz de muestra o la configuración de la instrumentación y evaluar si el estándar interno seleccionado reacciona de la misma manera que el analito. [dieciséis]
Una forma de visualizar el método del estándar interno es crear una curva de calibración que no utilice el método y una curva de calibración que sí lo haga. Supongamos que hay concentraciones conocidas de níquel en un conjunto de soluciones de calibración: 0 ppm, 1,6 ppm, 3,2 ppm, 4,8 ppm, 6,4 ppm y 8 ppm. Cada solución también tiene 5 ppm de itrio para actuar como estándar interno. Si estas soluciones se miden utilizando ICP-OES, la intensidad de la señal de itrio debe ser constante en todas las soluciones. De lo contrario, es probable que la intensidad de la señal de níquel también sea imprecisa.
La curva de calibración que no utiliza el método del estándar interno ignora la incertidumbre entre mediciones. El coeficiente de determinación (R 2 ) para este gráfico es 0,9985.
En la curva de calibración que utiliza el estándar interno, el eje y es la relación entre la señal de níquel y la señal de itrio. Esta relación no se ve afectada por la incertidumbre en las mediciones de níquel, ya que debería afectar las mediciones de itrio de la misma manera. Esto da como resultado un R2 más alto , 0,9993.