Un espliceosoma es un complejo de ribonucleoproteína grande (RNP) que se encuentra principalmente dentro del núcleo de las células eucariotas . El espliceosoma se ensambla a partir de ARN nucleares pequeños ( ARNnp ) y numerosas proteínas. Las moléculas de ARN nuclear pequeño (ARNnp) se unen a proteínas específicas para formar un complejo de ribonucleoproteína nuclear pequeño (RNPp, pronunciado "snurps"), que a su vez se combina con otros RNPp para formar un complejo de ribonucleoproteína grande llamado espliceosoma. El espliceosoma elimina intrones de un pre-ARNm transcrito , un tipo de transcripción primaria . Este proceso generalmente se conoce como empalme . [1] Una analogía es un editor de películas, que recorta selectivamente material irrelevante o incorrecto (equivalente a los intrones ) de la película inicial y envía la versión limpiada al director para el corte final. [ cita requerida ]
Sin embargo, a veces el ARN dentro del intrón actúa como un ribozima, empalmándose sin el uso de un espliceosoma o enzimas proteicas. [ cita requerida ]
En 1977, el trabajo de los laboratorios Sharp y Roberts reveló que los genes de los organismos superiores están "divididos" o presentes en varios segmentos distintos a lo largo de la molécula de ADN. [2] [3] Las regiones codificantes del gen están separadas por ADN no codificante que no está involucrado en la expresión de proteínas. La estructura del gen dividido se encontró cuando los ARNm adenovirales se hibridaron con fragmentos de escisión endonucleasa de ADN viral monocatenario. [2] Se observó que los ARNm de los híbridos ARNm-ADN contenían colas 5' y 3' de regiones no unidas por enlaces de hidrógeno. Cuando se utilizaron fragmentos más grandes de ADN viral, se observaron estructuras bifurcadas de ADN en bucle cuando se hibridaron con los ARNm virales. Se descubrió que las regiones en bucle, los intrones , se escinden de los ARNm precursores en un proceso que Sharp llamó "empalme". Posteriormente se descubrió que la estructura del gen dividido era común a la mayoría de los genes eucariotas . Phillip Sharp y Richard J. Roberts recibieron el Premio Nobel de Medicina en 1993 por el descubrimiento de los intrones y el proceso de empalme.
Cada espliceosoma está compuesto por cinco ARN nucleares pequeños (snRNA) y una variedad de factores proteicos asociados. Cuando estos ARN pequeños se combinan con los factores proteicos, forman complejos ARN-proteína llamados snRNP ( small nuclear r ibo n ucleo proteins , pronunciado "snurps"). Los snRNA que forman el espliceosoma principal se denominan U1 , U2 , U4 , U5 y U6 , llamados así porque son ricos en uridina y participan en varias interacciones ARN-ARN y ARN-proteína. [1]
El ensamblaje del espliceosoma se produce en cada pre-ARNm (también conocido como ARN nuclear heterogéneo, ARN-hn) en cada unión exón:intrón. Los intrones del pre-ARNm contienen elementos de secuencia específicos que se reconocen y utilizan durante el ensamblaje del espliceosoma. Estos incluyen el sitio de empalme del extremo 5', la secuencia del punto de ramificación, el tracto de polipirimidina y el sitio de empalme del extremo 3'. El espliceosoma cataliza la eliminación de intrones y la ligadura de los exones flanqueantes. [ cita requerida ]
Los intrones suelen tener una secuencia de nucleótidos GU en el sitio de empalme del extremo 5' y una AG en el sitio de empalme del extremo 3'. El sitio de empalme 3' se puede definir además mediante una longitud variable de polipirimidinas, denominada tracto de polipirimidinas (PPT), que cumple la doble función de reclutar factores al sitio de empalme 3' y posiblemente a la secuencia del punto de ramificación (BPS). El BPS contiene la adenosina conservada necesaria para el primer paso del empalme. [ cita requerida ]
Muchas proteínas presentan un motivo de unión al zinc, lo que subraya la importancia del zinc en el mecanismo de empalme. [4] [5] [6] La primera reconstrucción de resolución molecular del complejo de ribonucleoproteína nuclear pequeña triple (tri-snRNP) U4/U6.U5 se informó en 2016. [7]
Shi et al. han aplicado ampliamente la crio-EM para dilucidar la estructura atómica/casi-atómica del espliceosoma tanto en levaduras [9] como en humanos. [10] El marco molecular del espliceosoma con una resolución casi atómica demuestra que el componente Spp42 de U5 snRNP forma un andamiaje central y ancla el centro catalítico en levaduras. La estructura atómica del espliceosoma humano ilustra que el componente Slu7 del paso II adopta una estructura extendida, preparada para la selección del sitio de empalme 3'. Los cinco metales (asignados como Mg2+) en el complejo de levadura se conservan en el complejo humano. [ cita requerida ]
El empalme alternativo (la recombinación de diferentes exones ) es una fuente importante de diversidad genética en eucariotas. Las variantes de empalme se han utilizado para explicar el número relativamente pequeño de genes codificadores de proteínas en el genoma humano , que actualmente se estima en alrededor de 20.000. Se ha especulado que un gen particular de Drosophila , Dscam , se empalma alternativamente en 38.000 ARNm diferentes , suponiendo que todos sus exones pueden empalmarse independientemente unos de otros. [11]
Originalmente se descubrió que los factores de empalme del pre-ARNm se concentraban en cuerpos nucleares conocidos como motas nucleares. [12] Originalmente se postuló que las motas nucleares son sitios de empalme del ARNm o sitios de almacenamiento de factores de empalme del ARNm. Ahora se entiende que las motas nucleares ayudan a concentrar los factores de empalme cerca de los genes que están ubicados físicamente cerca de ellas. Los genes ubicados más lejos de las motas aún pueden transcribirse y empalmarse, pero su empalme es menos eficiente en comparación con aquellos más cercanos a las motas. [13] El empalme del ARN es una reacción bioquímica y, como todas las reacciones bioquímicas, su velocidad depende de la concentración de enzimas y sustratos. En este caso, las enzimas son los espliceosomas y los sustratos son los pre-ARNm. Al variar la concentración de espliceosomas y pre-ARNm en función de su proximidad a las motas nucleares, las células podrían potencialmente regular la eficiencia del empalme. [13]
El modelo para la formación del sitio activo del espliceosoma implica un ensamblaje ordenado y escalonado de partículas snRNP discretas en el sustrato del pre-ARNm. El primer reconocimiento de los pre-ARNm implica la unión de U1 snRNP al sitio de empalme del extremo 5' del pre-ARNm y otros factores no asociados a snRNP para formar el complejo de compromiso, o complejo temprano (E) en mamíferos. [14] [15] El complejo de compromiso es un complejo independiente de ATP que compromete al pre-ARNm con la vía de empalme. [16] U2 snRNP se recluta a la región de ramificación a través de interacciones con el componente del complejo E U2AF (factor auxiliar de U2 snRNP) y posiblemente U1 snRNP. En una reacción dependiente de ATP, U2 snRNP se asocia estrechamente con la secuencia del punto de ramificación (BPS) para formar el complejo A. Un dúplex formado entre U2 snRNP y la región de ramificación del pre-ARNm hace que la adenosina de la ramificación se hinche y se convierta en el nucleófilo para la primera transesterificación. [17]
La presencia de un residuo de pseudouridina en el ARNm pequeño U2, casi opuesto al sitio de ramificación, da como resultado una conformación alterada del dúplex ARN-ARN tras la unión del ARNm pequeño U2. Específicamente, la estructura alterada del dúplex inducida por la pseudouridina coloca el OH 2' de la adenosina abultada en una posición favorable para el primer paso del empalme. [18] El tri-snRNP U4/U5/U6 (ver Figura 1) es reclutado al espliceosoma en ensamblaje para formar el complejo B, y luego de varios reordenamientos, el complejo C se activa para la catálisis. [19] [20] No está claro cómo el tri-snRNP es reclutado al complejo A, pero este proceso puede estar mediado por interacciones proteína-proteína y/o interacciones de apareamiento de bases entre el ARNm pequeño U2 y el ARNm pequeño U6. [ cita requerida ]
El snRNP U5 interactúa con secuencias en los sitios de empalme 5' y 3' a través del bucle invariante del snRNA U5 [21] y los componentes de la proteína U5 interactúan con la región del sitio de empalme 3'. [22]
Tras el reclutamiento del tri-snRNP, varios reordenamientos ARN-ARN preceden al primer paso catalítico y se producen reordenamientos adicionales en el espliceosoma catalíticamente activo. Varias de las interacciones ARN-ARN son mutuamente excluyentes; sin embargo, no se sabe qué desencadena estas interacciones, ni el orden de estos reordenamientos. El primer reordenamiento es probablemente el desplazamiento de U1 snRNP del sitio de empalme 5' y la formación de una interacción U6 snRNA. Se sabe que U1 snRNP solo está débilmente asociado con espliceosomas completamente formados, [23] y U1 snRNP inhibe la formación de una interacción U6-sitio de empalme 5' en un modelo de oligonucleótido sustrato que contiene un exón 5' corto y un sitio de empalme 5'. [24] La unión de U2 snRNP a la secuencia del punto de ramificación (BPS) es un ejemplo de una interacción ARN-ARN que desplaza una interacción proteína-ARN. Tras el reclutamiento de U2 snRNP, la proteína de unión a la rama SF1 en el complejo de compromiso se desplaza ya que el sitio de unión de U2 snRNA y SF1 son eventos mutuamente excluyentes. [ cita requerida ]
Dentro del ARNm pequeño U2, hay otros reordenamientos mutuamente excluyentes que ocurren entre conformaciones en competencia. Por ejemplo, en la forma activa, se favorece el bucle de tallo IIa; en la forma inactiva predomina una interacción mutuamente excluyente entre el bucle y una secuencia corriente abajo. [20] No está claro cómo se desplaza U4 del ARNm pequeño U6, aunque el ARN se ha implicado en el ensamblaje del espliceosoma, y puede funcionar para desenrollar U4/U6 y promover la formación de una interacción de ARNm pequeño U2/U6. Las interacciones de los bucles de tallo I y II de U4/U6 se disocian y la región del bucle de tallo II liberada de U6 se pliega sobre sí misma para formar un bucle de tallo intramolecular y U4 ya no es necesaria para un mayor ensamblaje del espliceosoma. La región de tallo I liberada de U6 se aparea con el ARNm U2 snRNA formando la hélice I U2/U6. Sin embargo, la estructura de la hélice I es mutuamente excluyente con la mitad 3' de una región de tallo I interna 5' del ARNm U2 snRNA. [ cita requerida ]
Algunos eucariotas tienen un segundo espliceosoma, el llamado espliceosoma menor . [25] Un grupo de snRNA menos abundantes, U11 , U12 , U4atac y U6atac , junto con U5, son subunidades del espliceosoma menor que empalma una clase rara de intrones de pre-ARNm, denominados de tipo U12. El espliceosoma menor se encuentra en el núcleo como su contraparte principal, [26] aunque hay excepciones en algunas células especializadas, incluidas las plaquetas anucleadas [27] y el dendroplasma ( citoplasma dendrítico ) de las células neuronales. [28]
