El ensayo de electroforesis en gel unicelular ( SCGE , también conocido como ensayo cometa ) es una técnica sencilla y sensible para la detección de daños en el ADN a nivel de cada célula eucariota . Fue desarrollado por primera vez por Östling & Johansson en 1984 y posteriormente modificado por Singh et al. en 1988. [1] Desde entonces, ha aumentado su popularidad como técnica estándar para la evaluación del daño/reparación del ADN, el biomonitoreo y las pruebas de genotoxicidad. Implica la encapsulación de células en una suspensión de agarosa de bajo punto de fusión, la lisis de las células en condiciones neutras o alcalinas (pH>13) y la electroforesis de las células lisadas suspendidas. El término "cometa" se refiere al patrón de migración del ADN a través del gel de electroforesis, que a menudo se parece a un cometa. [2] [3]
El ensayo del cometa (electroforesis en gel unicelular) es un método sencillo para medir las roturas de las cadenas de ácido desoxirribonucleico (ADN) en células eucariotas. Las células incluidas en agarosa en un portaobjetos de microscopio se lisan con detergente y un alto contenido de sal para formar nucleoides que contienen bucles superenrollados de ADN unidos a la matriz nuclear. La electroforesis a pH alto da como resultado estructuras que se asemejan a los cometas, observadas mediante microscopía de fluorescencia; la intensidad de la cola del cometa en relación con la cabeza refleja el número de roturas del ADN. La base probable para esto es que los bucles que contienen una rotura pierden su superenrollamiento y quedan libres para extenderse hacia el ánodo. A esto le sigue un análisis visual con tinción del ADN y cálculo de la fluorescencia para determinar el alcance del daño en el ADN. Esto se puede realizar mediante puntuación manual o automáticamente mediante software de imágenes. [4] [5]
Una muestra de células, ya sea derivada de un cultivo celular in vitro o de un sujeto de prueba in vivo, se dispersa en células individuales y se suspende en agarosa fundida de bajo punto de fusión a 37 °C. Esta monosuspensión se moldea sobre un portaobjetos de microscopio . Se sostiene un cubreobjetos de vidrio en ángulo y se aplica la monosuspensión al punto de contacto entre el cubreobjetos y el portaobjetos. A medida que se baja el cubreobjetos sobre el portaobjetos, la agarosa fundida se extiende para formar una capa fina. La agarosa se gelifica a 4 °C y se retira el cubreobjetos.
La agarosa forma una matriz de fibras de carbohidratos que encapsulan las células y las anclan en su lugar. La agarosa se considera osmótica -neutra, por lo tanto las soluciones pueden penetrar el gel y afectar a las células sin que las células cambien de posición.
En un estudio in vitro, las células se expondrían a un agente de prueba (normalmente luz ultravioleta , radiación ionizante o una sustancia química genotóxica ) para inducir daños en el ADN de las células encapsuladas. Para la calibración , generalmente se usa peróxido de hidrógeno para proporcionar un nivel estandarizado de daño al ADN.
Luego, los portaobjetos se sumergen en una solución que provoca la lisis de las células . La solución de lisis que se utiliza a menudo en el ensayo del cometa consiste en una sal acuosa altamente concentrada (a menudo se puede utilizar sal de mesa común) y un detergente (como Triton X-100 o sarcosinato ). El pH de la solución de lisis se puede ajustar (generalmente entre pH neutro y alcalino ) según el tipo de daño que esté investigando el investigador.
La sal acuosa altera las proteínas y sus patrones de unión dentro de la célula, además de alterar el contenido de ARN de la célula. El detergente disuelve las membranas celulares . Mediante la acción de la solución de lisis se destruyen las células. Todas las proteínas, ARN, membranas y constituyentes citoplasmáticos y nucleoplásmicos se rompen y difunden hacia la matriz de agarosa. Sólo queda el ADN de la célula, que se deshace para llenar la cavidad en la agarosa que antes ocupaba toda la célula. Esta estructura se llama nucleoide (término general para una estructura en la que se concentra el ADN).
Después de la lisis de las células (normalmente de 1 a 2 horas a 4 °C), los portaobjetos se lavan en agua destilada para eliminar todas las sales y se sumergen en una segunda solución: una solución de electroforesis . Nuevamente, se puede ajustar el pH de esta solución dependiendo del tipo de daño que se esté investigando.
Los portaobjetos se dejan durante aproximadamente 20 minutos en la solución de electroforesis antes de aplicar un campo eléctrico . En condiciones alcalinas la doble hélice del ADN se desnaturaliza y el nucleoide se vuelve monocatenario.
Se aplica un campo eléctrico (normalmente 1 V / cm ) durante ~20 minutos. Luego, los portaobjetos se neutralizan a pH 7, se tiñen con una tinción fluorescente específica de ADN y se analizan utilizando un microscopio con un CCD ( dispositivo de carga acoplada , esencialmente una cámara digital ) conectado a una computadora con un software de análisis de imágenes .
El concepto subyacente al ensayo SCGE es que el ADN intacto conserva una asociación altamente organizada con las proteínas de la matriz en el núcleo. Cuando se daña, esta organización se altera. Las hebras individuales de ADN pierden su estructura compacta y se relajan, expandiéndose fuera de la cavidad hacia la agarosa. Cuando se aplica el campo eléctrico, el ADN, que tiene una carga general negativa, es atraído hacia el ánodo cargado positivamente. Las hebras de ADN no dañadas son demasiado grandes y no salen de la cavidad, mientras que cuanto más pequeños son los fragmentos, más libertad tienen para moverse en un período de tiempo determinado. Por lo tanto, la cantidad de ADN que sale de la cavidad es una medida de la cantidad de daño al ADN en la célula.
El análisis de imágenes mide la intensidad general de la fluorescencia de todo el nucleoide y la fluorescencia del ADN migrado y compara las dos señales. Cuanto más fuerte sea la señal del ADN migrado, más daño habrá. La estructura general se asemeja a un cometa (de ahí el "ensayo de cometa") con una cabeza circular que corresponde al ADN intacto que permanece en la cavidad y una cola de ADN dañado. Cuanto más brillante y larga sea la cola, mayor será el nivel de daño.
El ensayo cometa es una técnica versátil para detectar daños y, con ajustes en el protocolo, se puede utilizar para cuantificar la presencia de una amplia variedad de lesiones (daños) que alteran el ADN. Los daños que se suelen detectar son roturas de una sola hebra y roturas de dos hebras. A veces se afirma [6] [7] que son necesarias condiciones alcalinas y una desnaturalización completa del ADN para detectar roturas de una sola cadena. Sin embargo, esto no es cierto: en condiciones neutras también se detectan roturas tanto de una como de dos hebras. [8] [9] [10] [11] Sin embargo, en condiciones alcalinas, se detectan estructuras de ADN adicionales como daño en el ADN: sitios AP (sitios básicos a los que les falta un nucleótido de pirimidina o purina ) y sitios donde se está llevando a cabo la reparación por escisión . [12] [13]
El ensayo del cometa es un ensayo de daño al ADN extremadamente sensible. Esta sensibilidad debe manejarse con cuidado ya que también es vulnerable a cambios físicos que pueden afectar la reproducibilidad de los resultados. Esencialmente, se debe evitar cualquier cosa que pueda causar daño o desnaturalización del ADN, excepto los factores que se están investigando. [14] La forma más común del ensayo es la versión alcalina, aunque todavía no existe un protocolo de ensayo alcalino definitivo. Debido a su configuración simple y económica, se puede utilizar en condiciones donde no se encuentran disponibles ensayos más complejos.
Estos incluyen pruebas de genotoxicidad, biomonitoreo humano y epidemiología molecular, ecogenotoxicología, así como investigaciones fundamentales sobre daños y reparación del ADN. [15] Por ejemplo, Swain y Rao, utilizando el ensayo del cometa [16] , informaron aumentos marcados en varios tipos de daños en el ADN en neuronas y astrocitos del cerebro de rata durante el envejecimiento , incluidas roturas de una sola hebra, roturas de doble hebra y bases modificadas (8 -OHdG y uracilo).
Un ensayo de cometa puede determinar el grado de fragmentación del ADN en los espermatozoides. El grado de fragmentación del ADN se ha asociado con los resultados de la fertilización in vitro . [17] [18]
El cometa ha sido modificado para su uso con espermatozoides como herramienta para el diagnóstico de infertilidad masculina [19] [20] [21]
Para descomponer estas proteínas protamina estrechamente unidas y poder utilizar el cometa como esperma, se requieren pasos adicionales en el protocolo de descondensación. [20]