En genética , un potenciador es una región corta (50-1500 pb ) de ADN que puede ser unida por proteínas ( activadores ) para aumentar la probabilidad de que ocurra la transcripción de un gen en particular. [1] [2] Estas proteínas generalmente se conocen como factores de transcripción . Los potenciadores actúan en cis . Pueden ubicarse hasta a 1 Mbp (1.000.000 pb) de distancia del gen, aguas arriba o aguas abajo del sitio de inicio. [2] [3] Hay cientos de miles de potenciadores en el genoma humano. [2] Se encuentran tanto en procariotas como en eucariotas. [4] Los potenciadores activos generalmente se transcriben como ARN no codificante potenciador o regulador, cuyos niveles de expresión se correlacionan con los niveles de ARNm de los genes diana. [5]
El primer descubrimiento de un potenciador eucariota fue en el gen de la cadena pesada de inmunoglobulina en 1983. [6] [7] [8] Este potenciador, ubicado en el intrón grande , proporcionó una explicación para la activación transcripcional de los promotores del gen Vh reordenados mientras que los promotores Vh no reordenados permanecieron inactivos. [9] Últimamente, se ha demostrado que los potenciadores están involucrados en ciertas condiciones médicas, por ejemplo, la mielosupresión . [10] Desde 2022, los científicos han utilizado inteligencia artificial para diseñar potenciadores sintéticos y los han aplicado en sistemas animales, primero en una línea celular, [11] y un año después también in vivo. [12] [13]
En las células eucariotas, la estructura del complejo de cromatina del ADN está plegada de una manera que imita funcionalmente el estado superenrollado característico del ADN procariota , por lo que, aunque el ADN potenciador puede estar lejos del gen de forma lineal, está espacialmente cerca del promotor y del gen. Esto le permite interactuar con los factores de transcripción generales y la ARN polimerasa II . [14] El mismo mecanismo es válido para los silenciadores en el genoma eucariota. Los silenciadores son antagonistas de los potenciadores que, cuando se unen a sus factores de transcripción adecuados llamados represores , reprimen la transcripción del gen. Los silenciadores y potenciadores pueden estar muy cerca uno del otro o incluso pueden estar en la misma región, solo diferenciados por el factor de transcripción al que se une la región.
Un potenciador puede estar ubicado aguas arriba o aguas abajo del gen que regula. Además, un potenciador no necesita estar ubicado cerca del sitio de inicio de la transcripción para afectar la transcripción, ya que se han encontrado algunos ubicados varios cientos de miles de pares de bases aguas arriba o aguas abajo del sitio de inicio. [15] Los potenciadores no actúan sobre la región promotora en sí, sino que están unidos por proteínas activadoras como lo demostraron por primera vez los experimentos de competencia in vivo. [16] [17] Posteriormente, los estudios moleculares mostraron interacciones directas con factores de transcripción y cofactores, incluido el complejo mediador , que recluta la polimerasa II y los factores de transcripción generales que luego comienzan a transcribir los genes. [18] [19] Los potenciadores también se pueden encontrar dentro de los intrones. La orientación de un potenciador incluso puede invertirse sin afectar su función; además, un potenciador puede extirparse e insertarse en otra parte del cromosoma y aún así afectar la transcripción genética. [8] Esa es una de las razones por las que los polimorfismos de los intrones pueden tener efectos aunque no se traduzcan . [ cita requerida ] Los potenciadores también se pueden encontrar en la región exónica de un gen no relacionado [20] [21] [22] y pueden actuar sobre genes de otro cromosoma . [23]
Los potenciadores están unidos por p300-CBP y su ubicación se puede predecir mediante ChIP-seq contra esta familia de coactivadores. [24] [25] [26] [27]
La expresión génica en mamíferos está regulada por muchos elementos cis-reguladores , incluidos los promotores centrales y los elementos proximales al promotor que se encuentran cerca de los sitios de inicio de la transcripción de los genes. Los promotores centrales son suficientes para dirigir la iniciación de la transcripción, pero generalmente tienen una actividad basal baja. [28] Otros módulos cis-reguladores importantes se localizan en regiones de ADN que están distantes de los sitios de inicio de la transcripción. Estos incluyen potenciadores, silenciadores , aisladores y elementos de anclaje. [29] Entre esta constelación de elementos, los potenciadores y sus factores de transcripción asociados tienen un papel principal en la regulación de la expresión génica. [30] Un potenciador localizado en una región de ADN distante del promotor de un gen puede tener un efecto muy grande en la expresión génica, con algunos genes experimentando una expresión hasta 100 veces mayor debido a un potenciador activado. [31]
Los potenciadores son regiones del genoma que son elementos importantes de regulación de genes. Los potenciadores controlan programas de expresión de genes específicos de cada tipo de célula, la mayoría de las veces mediante bucles a través de largas distancias para llegar a la proximidad física con los promotores de sus genes objetivo. [32] Si bien existen cientos de miles de regiones de ADN potenciadoras, [2] para un tipo particular de tejido solo los potenciadores específicos se acercan a los promotores que regulan. En un estudio de neuronas corticales cerebrales, se encontraron 24.937 bucles, que llevaban potenciadores a sus promotores objetivo. [31] Múltiples potenciadores, cada uno a menudo a decenas o cientos de miles de nucleótidos de distancia de sus genes objetivo, se unen a sus promotores de genes objetivo y pueden coordinarse entre sí para controlar la expresión de su gen objetivo común. [32]
La ilustración esquemática de esta sección muestra un potenciador que forma un bucle para acercarse físicamente al promotor de un gen diana. El bucle está estabilizado por un dímero de una proteína conectora (por ejemplo, el dímero de CTCF o YY1 ), con un miembro del dímero anclado a su motivo de unión en el potenciador y el otro miembro anclado a su motivo de unión en el promotor (representado por los zigzags rojos en la ilustración). [33] Varios factores de transcripción específicos de la función celular (hay alrededor de 1.600 factores de transcripción en una célula humana [34] ) generalmente se unen a motivos específicos en un potenciador [35] y una pequeña combinación de estos factores de transcripción unidos al potenciador, cuando se acercan a un promotor mediante un bucle de ADN, gobiernan el nivel de transcripción del gen diana. El mediador (un complejo que generalmente consta de alrededor de 26 proteínas en una estructura interactuante) comunica señales reguladoras de los factores de transcripción unidos al ADN del potenciador directamente a la enzima ARN polimerasa II (pol II) unida al promotor. [36]
Los potenciadores, cuando están activos, generalmente se transcriben a partir de ambas cadenas de ADN con ARN polimerasas que actúan en dos direcciones diferentes, produciendo dos ARN potenciadores (eARN), como se ilustra en la Figura. [37] Al igual que los ARNm , estos eARN suelen estar protegidos por su capuchón 5′ . [38] Un potenciador inactivo puede estar unido a un factor de transcripción inactivo. La fosforilación del factor de transcripción puede activarlo y ese factor de transcripción activado puede entonces activar el potenciador al que está unido (ver la pequeña estrella roja que representa la fosforilación del factor de transcripción unido al potenciador en la ilustración). [39] Un potenciador activado comienza la transcripción de su ARN antes de activar la transcripción del ARN mensajero de su gen diana. [40]
A partir de 2005 [actualizar], existen dos teorías diferentes sobre el procesamiento de la información que ocurre en los potenciadores: [41]
HACNS1 (también conocido como CENTG2 y ubicado en la Región Acelerada Humana 2) es un potenciador genético "que puede haber contribuido a la evolución del pulgar humano , que es único y oponible, y posiblemente también a las modificaciones en el tobillo o el pie que permiten a los humanos caminar sobre dos piernas". La evidencia hasta la fecha muestra que de las 110.000 secuencias potenciadoras de genes identificadas en el genoma humano , HACNS1 ha sufrido el mayor cambio durante la evolución de los humanos después de la división con los ancestros de los chimpancés . [ cita requerida ]
Se ha descrito un potenciador cerca del gen GADD45g que puede regular el crecimiento cerebral en chimpancés y otros mamíferos, pero no en humanos. [42] El regulador GADD45G en ratones y chimpancés está activo en regiones del cerebro donde se encuentran las células que forman la corteza, el prosencéfalo ventral y el tálamo y puede suprimir la neurogénesis posterior. La pérdida del potenciador GADD45G en humanos puede contribuir a un aumento de ciertas poblaciones neuronales y a la expansión del prosencéfalo en humanos. [ cita requerida ]
El desarrollo, la diferenciación y el crecimiento de células y tejidos requieren patrones de expresión genética regulados con precisión . Los potenciadores funcionan como elementos cisreguladores para mediar el control espacial y temporal del desarrollo activando la transcripción en células específicas y/o reprimiéndola en otras células. Por lo tanto, la combinación particular de factores de transcripción y otras proteínas de unión al ADN en un tejido en desarrollo controla qué genes se expresarán en ese tejido. Los potenciadores permiten que el mismo gen se utilice en diversos procesos en el espacio y el tiempo. [ cita requerida ] [43]
Tradicionalmente, los potenciadores se identificaban mediante técnicas de trampa de potenciadores utilizando un gen reportero o mediante análisis de secuencia comparativo y genómica computacional. En modelos genéticamente manejables como la mosca de la fruta Drosophila melanogaster , por ejemplo, un constructo reportero como el gen lacZ se puede integrar aleatoriamente en el genoma utilizando un transposón del elemento P. Si el gen reportero se integra cerca de un potenciador, su expresión reflejará el patrón de expresión impulsado por ese potenciador. Por lo tanto, la tinción de las moscas para la expresión o actividad de LacZ y la clonación de la secuencia que rodea el sitio de integración permite la identificación de la secuencia potenciadora. [44]
Sin embargo, el desarrollo de tecnologías genómicas y epigenómicas ha cambiado drásticamente las perspectivas para el descubrimiento de módulos cis-reguladores (CRM). Los métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) ahora permiten ensayos de descubrimiento de CRM funcionales de alto rendimiento, y las cantidades cada vez mayores de datos disponibles, incluidas bibliotecas a gran escala de motivos de sitios de unión de factores de transcripción (TFBS) , colecciones de CRM anotados y validados y datos epigenéticos extensos en muchos tipos de células, están haciendo que el descubrimiento computacional preciso de CRM sea una meta alcanzable. Un ejemplo de enfoque basado en NGS llamado DNase-seq ha permitido la identificación de regiones de cromatina abiertas o agotadas de nucleosomas, que pueden contener CRM. Más recientemente, se han desarrollado técnicas como ATAC-seq que requieren menos material de partida. Las regiones agotadas de nucleosomas se pueden identificar in vivo a través de la expresión de Dam metilasa , lo que permite un mayor control de la identificación de potenciadores específicos del tipo de célula. [45] Los métodos computacionales incluyen genómica comparativa , agrupamiento de sitios de unión de TF conocidos o predichos y enfoques de aprendizaje automático supervisado entrenados en CRM conocidos. Todos estos métodos han demostrado ser efectivos para el descubrimiento de CRM, pero cada uno tiene sus propias consideraciones y limitaciones, y cada uno está sujeto a un mayor o menor número de identificaciones de falsos positivos. [46] En el enfoque de genómica comparativa , la conservación de la secuencia de regiones no codificantes puede ser indicativa de potenciadores. Las secuencias de múltiples especies se alinean y las regiones conservadas se identifican computacionalmente. [47] Las secuencias identificadas se pueden unir luego a un gen reportero como la proteína fluorescente verde o lacZ para determinar el patrón in vivo de expresión génica producida por el potenciador cuando se inyecta en un embrión. La expresión de ARNm del reportero se puede visualizar mediante hibridación in situ , que proporciona una medida más directa de la actividad del potenciador, ya que no está sujeta a las complejidades de la traducción y el plegamiento de proteínas . Aunque muchas evidencias apuntan a la conservación de secuencias en el caso de potenciadores críticos del desarrollo, otros trabajos han demostrado que la función de los potenciadores se puede conservar con poca o ninguna conservación de secuencia primaria. Por ejemplo, los potenciadores RET en humanos tienen muy poca conservación de secuencias en comparación con los del pez cebra., sin embargo, las secuencias de ambas especies producen patrones casi idénticos de expresión de genes reporteros en el pez cebra. [47] De manera similar, en insectos altamente divergentes (separados por alrededor de 350 millones de años), se encontró que patrones de expresión genética similares de varios genes clave estaban regulados a través de CRM constituidos de manera similar, aunque estos CRM no muestran ninguna conservación de secuencia apreciable detectable por métodos de alineamiento de secuencias estándar como BLAST . [48]
Los potenciadores que determinan la segmentación temprana en embriones de Drosophila melanogaster se encuentran entre los potenciadores del desarrollo mejor caracterizados. En el embrión temprano de la mosca, los factores de transcripción del gen gap son responsables de activar y reprimir una serie de genes de segmentación, como los genes pair-rule . Los genes gap se expresan en bloques a lo largo del eje anteroposterior de la mosca junto con otros factores de transcripción de efecto materno , creando así zonas dentro de las cuales se expresan diferentes combinaciones de factores de transcripción. Los genes pair-rule están separados entre sí por células que no se expresan. Además, las franjas de expresión para diferentes genes pair-rule están desplazadas por unos pocos diámetros celulares entre sí. Por lo tanto, las combinaciones únicas de expresión del gen pair-rule crean dominios espaciales a lo largo del eje anteroposterior para configurar cada uno de los 14 segmentos individuales. El potenciador de 480 pb responsable de impulsar la franja aguda dos del gen pair-rule even-skipped ( eve ) ha sido bien caracterizado. El potenciador contiene 12 sitios de unión diferentes para los factores de transcripción de los genes maternos y gap. Los sitios de activación y represión se superponen en la secuencia. Eve solo se expresa en una franja estrecha de células que contienen altas concentraciones de los activadores y bajas concentraciones de los represores para esta secuencia potenciadora. Otras regiones potenciadoras impulsan la expresión de eve en otras 6 franjas en el embrión. [49]
El establecimiento de los ejes corporales es un paso crítico en el desarrollo animal. Durante el desarrollo embrionario del ratón, Nodal , un ligando de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta , es un gen clave involucrado en la formación de patrones tanto del eje anteroposterior como del eje izquierda-derecha del embrión temprano. El gen Nodal contiene dos potenciadores: el potenciador del epiblasto proximal (PEE) y el potenciador asimétrico (ASE). El PEE se encuentra aguas arriba del gen Nodal e impulsa la expresión de Nodal en la porción de la línea primitiva que se diferenciará en el nodo (también conocido como nodo primitivo ). [50] El PEE activa la expresión de Nodal en respuesta a una combinación de señalización de Wnt más una segunda señal desconocida; por lo tanto, un miembro de la familia de factores de transcripción LEF/TCF probablemente se une a un sitio de unión de TCF en las células del nodo. La difusión de Nodal fuera del nodo forma un gradiente que luego forma patrones del eje anteroposterior que se extiende del embrión. [51] El ASE es un potenciador intrónico unido al factor de transcripción del dominio de la cabeza de la horquilla Fox1. Al principio del desarrollo, la expresión de Nodal impulsada por Fox1 establece el endodermo visceral. Más adelante en el desarrollo, la unión de Fox1 al ASE impulsa la expresión de Nodal en el lado izquierdo del mesodermo de la placa lateral , estableciendo así la asimetría izquierda-derecha necesaria para el desarrollo asimétrico de órganos en el mesodermo. [52]
El establecimiento de tres capas germinales durante la gastrulación es otro paso crítico en el desarrollo animal. Cada una de las tres capas germinales tiene patrones únicos de expresión génica que promueven su diferenciación y desarrollo. El endodermo se especifica al principio del desarrollo mediante la expresión de Gata4 , y Gata4 pasa a dirigir la morfogénesis intestinal más tarde. La expresión de Gata4 está controlada en el embrión temprano por un potenciador intrónico que se une a otro factor de transcripción del dominio forkhead, FoxA2. Inicialmente, el potenciador impulsa la expresión génica amplia en todo el embrión, pero la expresión rápidamente se restringe al endodermo, lo que sugiere que otros represores pueden estar involucrados en su restricción. Más tarde en el desarrollo, el mismo potenciador restringe la expresión a los tejidos que se convertirán en el estómago y el páncreas. Un potenciador adicional es responsable de mantener la expresión de Gata4 en el endodermo durante las etapas intermedias del desarrollo intestinal. [53]
Algunos genes implicados en procesos críticos del desarrollo contienen múltiples potenciadores con funciones superpuestas. Los potenciadores secundarios, o "potenciadores de sombra", pueden encontrarse a muchas kilobases de distancia del potenciador primario ("primario" suele referirse al primer potenciador descubierto, que suele estar más cerca del gen que regula). Por sí solo, cada potenciador impulsa patrones casi idénticos de expresión génica. ¿Son los dos potenciadores realmente redundantes? Trabajos recientes han demostrado que múltiples potenciadores permiten a las moscas de la fruta sobrevivir a perturbaciones ambientales, como un aumento de temperatura. Cuando se crían a una temperatura elevada, un solo potenciador a veces no consigue impulsar el patrón completo de expresión, mientras que la presencia de ambos potenciadores permite la expresión génica normal. [54]
Un tema de investigación en biología evolutiva del desarrollo ("evo-devo") es investigar el papel de los potenciadores y otros elementos cisreguladores en la producción de cambios morfológicos a través de diferencias de desarrollo entre especies. [ cita requerida ]
Trabajos recientes han investigado el papel de los potenciadores en los cambios morfológicos en el pez espinoso de tres espinas. Los espinosos existen tanto en ambientes marinos como de agua dulce, pero los espinosos en muchas poblaciones de agua dulce han perdido completamente sus aletas pélvicas (apéndices homólogos a la extremidad posterior de los tetrápodos).
Pitx1 es un gen homeobox involucrado en el desarrollo de la extremidad posterior en vertebrados. Los análisis genéticos preliminares indicaron que los cambios en la expresión de este gen fueron responsables de la reducción pélvica en los espinosos. Los peces que expresan solo el alelo de agua dulce de Pitx1 no tienen espinas pélvicas, mientras que los peces que expresan un alelo marino conservan espinas pélvicas. Una caracterización más exhaustiva mostró que una secuencia potenciadora de 500 pares de bases es responsable de activar la expresión de Pitx1 en la yema de la aleta posterior. Este potenciador está ubicado cerca de un sitio frágil cromosómico , una secuencia de ADN que es probable que se rompa y, por lo tanto, es más probable que mute como resultado de una reparación imprecisa del ADN . Este sitio frágil ha causado pérdidas repetidas e independientes del potenciador responsable de impulsar la expresión de Pitx1 en las espinas pélvicas en una población de agua dulce aislada, y sin este potenciador, los peces de agua dulce no logran desarrollar espinas pélvicas. [55]
Los patrones de pigmentación proporcionan una de las diferencias más llamativas y fáciles de puntuar entre diferentes especies de animales. La pigmentación del ala de Drosophila ha demostrado ser un sistema particularmente adecuado para estudiar el desarrollo de fenotipos de pigmentación complejos. El ala de Drosophila guttifera tiene 12 manchas de pigmentación oscuras y 4 parches intervenosos de color gris más claro. Las manchas de pigmento surgen de la expresión del gen amarillo , cuyo producto produce melanina negra . Trabajos recientes han demostrado que dos potenciadores en el gen amarillo producen expresión génica precisamente en este patrón: el potenciador de la mancha venosa impulsa la expresión del gen reportero en los 12 puntos, y el potenciador del tono intervenoso impulsa la expresión del reportero en los 4 parches distintos. Estos dos potenciadores responden a la vía de señalización Wnt , que se activa por la expresión de wingless en todas las ubicaciones pigmentadas. Por lo tanto, en la evolución del fenotipo de pigmentación complejo , el gen del pigmento amarillo desarrolló potenciadores que responden a la señal de wingless y la expresión de wingless evolucionó en nuevas ubicaciones para producir nuevos patrones de alas. [56]
Cada célula contiene típicamente varios cientos de una clase especial de potenciadores que se extienden sobre secuencias de ADN de muchas kilobases de longitud, llamados " superpotenciadores ". [57] Estos potenciadores contienen una gran cantidad de sitios de unión para factores de transcripción inducibles específicos de la secuencia, y regulan la expresión de genes involucrados en la diferenciación celular. [58] Durante la inflamación , el factor de transcripción NF-κB facilita la remodelación de la cromatina de una manera que redistribuye selectivamente los cofactores de los potenciadores de alta ocupación, reprimiendo así los genes involucrados en el mantenimiento de la identidad celular cuya expresión mejoran; al mismo tiempo, esta remodelación y redistribución impulsada por F-κB activa otros potenciadores que guían los cambios en la función celular a través de la inflamación. [59] [60] Como resultado, la inflamación reprograma las células, alterando sus interacciones con el resto del tejido y con el sistema inmunológico. [61] [62] En el cáncer, las proteínas que controlan la actividad de NF-κB están desreguladas, lo que permite que las células malignas disminuyan su dependencia de las interacciones con el tejido local y dificulta su vigilancia por parte del sistema inmunológico . [63] [64]
Los elementos reguladores sintéticos, como los potenciadores, prometen ser una herramienta poderosa para dirigir los productos genéticos a tipos específicos de células con el fin de tratar enfermedades activando genes beneficiosos o deteniendo estados celulares aberrantes.
Desde 2022, la inteligencia artificial y las estrategias de aprendizaje por transferencia han permitido comprender mejor las características de las secuencias de ADN reguladoras, la predicción y el diseño de potenciadores sintéticos. [65] [66]
Basándose en el trabajo en cultivos celulares, [65] los potenciadores sintéticos se aplicaron con éxito a organismos vivos completos en 2023. Utilizando redes neuronales profundas , los científicos simularon la evolución de secuencias de ADN para analizar la aparición de características que subyacen a la función potenciadora. Esto permitió el diseño y la producción de una gama de potenciadores sintéticos funcionales para diferentes tipos de células del cerebro de la mosca de la fruta. [13] Un segundo enfoque entrenó modelos de inteligencia artificial en datos de accesibilidad de ADN de una sola célula y transfirió los modelos aprendidos hacia la predicción de potenciadores para tejidos seleccionados en el embrión de la mosca de la fruta. Estos modelos de predicción de potenciadores se utilizaron para diseñar potenciadores sintéticos para el sistema nervioso, el cerebro, los músculos, la epidermis y el intestino. [12]