El tubo polínico es una estructura tubular que produce el gametofito masculino de las plantas con semillas cuando germina. La elongación del tubo polínico es una etapa integral del ciclo de vida de la planta. El tubo polínico actúa como un conducto para transportar las células del gameto masculino desde el grano de polen , ya sea desde el estigma (en las plantas con flores ) hasta los óvulos en la base del pistilo o directamente a través del tejido del óvulo en algunas gimnospermas . En el maíz , esta única célula puede crecer más de 12 pulgadas (30 cm) para atravesar la longitud del pistilo .
Los tubos polínicos fueron descubiertos por primera vez por Giovanni Battista Amici en el siglo XIX.
Se utilizan como modelo para comprender el comportamiento de las células vegetales. Se están realizando investigaciones para comprender cómo responde el tubo polínico a las señales de guía extracelulares para lograr la fertilización.
Los tubos polínicos son exclusivos de las plantas con semillas y sus estructuras han evolucionado a lo largo de su historia desde el período Carbonífero. La formación de los tubos polínicos es compleja y el mecanismo no se comprende por completo. [1]
El órgano reproductor masculino de la flor, el estambre , produce polen. La apertura de las anteras hace que el polen esté disponible para la polinización posterior (transferencia de los granos de polen al pistilo , el órgano reproductor femenino). Cada grano de polen contiene una célula vegetativa y una célula generativa que se divide para formar dos espermatozoides . Los vectores abióticos como el viento , el agua o los vectores bióticos como los animales llevan a cabo la distribución del polen.
Una vez que un grano de polen se asienta en un pistilo compatible, puede germinar en respuesta a un fluido azucarado secretado por el estigma maduro. Los lípidos en la superficie del estigma también pueden estimular el crecimiento del tubo polínico para el polen compatible. Las plantas que son autoestériles a menudo inhiben el crecimiento de los tubos polínicos de los granos de polen de sus propias flores. Se ha observado que la presencia de múltiples granos de polen estimula un crecimiento más rápido del tubo polínico en algunas plantas. [2] La célula vegetativa luego produce el tubo polínico, una protuberancia tubular del grano de polen, que transporta los espermatozoides dentro de su citoplasma . Los espermatozoides son los gametos masculinos que se unirán con el óvulo y la célula central en la doble fertilización . El primer evento de fertilización produce un cigoto diploide y el segundo evento de fertilización produce un endospermo triploide .
El tubo polínico germinado debe perforar su camino a través del estilo rico en nutrientes y enroscarse hasta el fondo del ovario para alcanzar un óvulo. Una vez que el tubo polínico llega a un óvulo, se rompe para liberar los dos espermatozoides. Uno de los espermatozoides fecunda el óvulo que se desarrolla en un embrión, que se convertirá en la futura planta. El otro se fusiona con ambos núcleos polares de la célula central para formar el endospermo , que sirve como suministro de alimento al embrión. Finalmente, el ovario se desarrollará en un fruto y los óvulos en semillas .
El polen de las gimnospermas se produce en microsporangios que se encuentran en las escamas del cono masculino o microstrobilo . En la mayoría de las especies, las plantas son polinizadas por el viento y los granos de polen de las coníferas tienen vejigas de aire que proporcionan flotabilidad en las corrientes de aire. Los granos se depositan en el micrópilo del óvulo de un cono femenino o megastrobilo, donde maduran durante hasta un año. En las coníferas y las gnetofitas , el polen germina para producir un tubo polínico que penetra en el megasporangio o nucela llevando consigo núcleos de espermatozoides que se transfieren al óvulo en el arquegonio en desarrollo de la planta femenina. [3] [4]
El esporofito femenino debe reconocer el polen adherido al estigma. A menudo, solo el polen de la misma especie puede crecer con éxito. El polen exogamia crece con más éxito. [5] [6] Con los sistemas de autoincompatibilidad , el polen exogamia crece y supera al polen propio. La interacción entre el estilo y el polen detecta la compatibilidad e influye en la tasa de crecimiento del tubo polínico. [7] Este proceso de selección se basa en la regulación a nivel genético en la que los loci genéticos del gineceo permiten que el polen propio crezca lentamente, deje de crecer o explote mientras se produce un crecimiento más rápido del polen exogamia. Los sistemas de autoincompatibilidad mantienen la diversidad genética. [8] [9] En cuanto a las gimnospermas, no contienen un pistilo con un estigma. Por lo tanto, el polen debe sumergirse en la gota de polinización, llevando el gametofito masculino al óvulo del óvulo expuesto. Sin embargo, el polen de diferentes especies no se sumergirá en la gota; El polen queda flotando en la parte superior, mientras que la gota se retrae hacia el micrópilo. [10]
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Una vez que el grano de polen es reconocido e hidratado, germina para formar un tubo polínico. [11] En este paso hay competencia, ya que muchos granos de polen pueden competir para llegar al óvulo. El estigma desempeña un papel en la guía del espermatozoide hacia un óvulo receptivo, en el caso de muchos óvulos. [11] Solo se permite que crezcan los granos de polen compatibles, según lo determinado por la señalización con el estigma.
En el grano de polen, la célula generativa da lugar al espermatozoide, mientras que las células vegetativas tienen una célula tubular que hace crecer el tubo polínico. Algunas plantas tienen mecanismos para evitar la autopolinización, como que el estigma y la antera maduren en momentos diferentes o tengan longitudes diferentes, lo que contribuye significativamente a aumentar la diversidad genética de la siguiente generación. [12] [13]
Existe una gran variación en la tasa de crecimiento de los tubos polínicos y muchos estudios se han centrado en la señalización. [12] La expresión genética en el grano de polen se ha identificado como la del gametofito y no la del esporofito parental, ya que expresa su propio ARNm y enzimas únicos. [12] En el duraznero, el entorno estilístico a través del cual crece el tubo polínico proporciona nutrición para el crecimiento del tubo hasta el óvulo. [11] Los tubos polínicos son tolerantes e incluso el polen dañado por rayos X y rayos gamma puede seguir haciendo crecer tubos polínicos. [12]
El crecimiento del tubo polínico está influenciado por la interacción entre el estigma y el estilo y el grano de polen. La elongación del tubo se logra con la elongación del citoesqueleto y se extiende desde la punta, lo cual está regulado por altos niveles de calcio en el citosol. [9] Los niveles de calcio ayudan a que las vesículas sinápticas en las membranas crezcan y se extiendan en la punta. [6] Los polipéptidos que se encuentran en el estilo también regulan el crecimiento del tubo y se han identificado péptidos específicos que desempeñan un papel en la señalización del crecimiento.
Los péptidos LURE que se secretan de los sinergidos, que ocupan el espacio adyacente al óvulo, pueden utilizar atrayentes . En los embriones de plantas mutantes de Arabidopsis , específicamente en aquellos sin los sinergidos, los tubos polínicos no pudieron crecer [ cita requerida ] . El crecimiento del tubo polínico se realiza hacia los óvulos de la misma especie que el polen. La señalización intraespecífica ayuda a fertilizar el óvulo y el esperma de la misma especie. La señalización en el estilo es importante ya que los tubos polínicos pueden crecer sin la presencia de un saco embrionario con solo la interacción con el estilo. [9] [5] Otras partes del ovario incluyen factores citoplasmáticos como miRNA y gradientes químicos que atraen al tubo polínico para que crezca hacia los sinergidos. [5] [14]
El calcio y el etileno en Arabidopsis thaliana estuvieron involucrados en la terminación del tubo polínico cuando crece cerca del ovario. El aumento de calcio permitió la liberación de los dos espermatozoides del tubo, así como la degeneración de una célula sinérgica. [5] El gradiente químico de calcio también puede contribuir a la terminación temprana del crecimiento del tubo o en el momento adecuado. [14]
La longitud del tubo polínico varía según la especie. Crece de forma oscilante hasta que está listo para liberar el esperma cerca del óvulo para que se produzca la fecundación. [15] [16] Se han observado algunos tubos polínicos de rápido crecimiento en lirios, tabaco e Impatiens sultanii. [16] [17] La tasa de crecimiento confiere ventajas al organismo, pero no está claro si la variación en la tasa de crecimiento existe en la población o ha sido seleccionada a lo largo de generaciones debido a una mayor aptitud . [12]
Se han identificado muchas características transicionales que muestran correlación entre la evolución del tubo polínico con la de un espermatozoide no móvil. [13] Las primeras plantas con semillas como los helechos tienen esporas y espermatozoides móviles que nadan en un medio acuático, llamado zooidogamia . [18] El tubo polínico de las angiospermas es simple, no ramificado y de rápido crecimiento, sin embargo este no es el caso de las plantas ancestrales.
En gimnospermas como Ginkgo biloba y cycadophyta, se forma un tubo polínico haustorial . El tubo simplemente absorbe nutrientes de la nucela femenina y crece en dos etapas. El tubo polínico está muy ramificado y crece en los tejidos del esporofito femenino. Primero, crece el tubo principal seguido de una punta más esférica en el extremo para permitir que el esperma estalle cerca de la arquegonia. [18] El esperma binucleado y multiflagelado puede luego nadar hasta el óvulo. [13] Las cícadas tienen una estructura menos ramificada y el extremo de la punta se hincha de la misma manera que en el ginkgo . Sin embargo, en las cícadas, se han identificado varias enzimas en el tubo polínico que dirigen el crecimiento y los tejidos de la nucela se dañan más con el crecimiento del tubo. [18]
En otros filos de gimnospermas, las coniferofitas y las gnetófitas , el espermatozoide no es móvil y el tubo polínico lleva el espermatozoide directamente al óvulo, en un proceso llamado sifonogamia . Las coníferas pueden ser ramificadas o no ramificadas y causan degeneración del tejido femenino a medida que crece a través de más tejido. [ aclaración necesaria ] [18] Los pinos, por ejemplo, descargan el citoplasma del espermatozoide y la unión de un espermatozoide ocurre mientras el otro espermatozoide se degenera. Sin embargo, en las gnetófitas, hay características más similares a los tubos polínicos de las angiospermas donde el tubo llega al óvulo con una forma temprana de doble fertilización. Sin embargo, el endospermo no se forma y la segunda fertilización se aborta. [13]
En las angiospermas, el mecanismo se ha estudiado más extensamente, ya que los tubos polínicos de las plantas con flores crecen muy rápido a través de largos estilos para alcanzar el óvulo bien protegido. Existe una gran variación en los tubos polínicos de las angiospermas y se han estudiado muchas plantas modelo como la petunia, la Arabidopsis , el lirio y las plantas de tabaco en busca de variación intraespecífica y mecanismos de señalización. [12] En las plantas con flores, puede ocurrir un fenómeno llamado poliamor, en el que se fertilizan muchos óvulos y aún queda por estudiar la aptitud general del organismo con respecto a la tasa de crecimiento del tubo polínico. [ Aclaración necesaria ] [13] [12]
Los tubos polínicos son un excelente modelo para comprender el comportamiento de las células vegetales. [19] Se cultivan fácilmente in vitro y tienen un citoesqueleto muy dinámico que polimeriza a tasas muy altas, lo que proporciona al tubo polínico propiedades mecánicas interesantes. [20] El tubo polínico tiene un tipo de crecimiento inusual; se extiende exclusivamente en su ápice. Extender la pared celular solo en la punta minimiza la fricción entre el tubo y el tejido invadido. Este crecimiento de la punta se realiza de manera pulsante en lugar de de manera constante. [9] El viaje del tubo polínico a través del estilo a menudo da como resultado relaciones de profundidad a diámetro superiores a 100:1 y hasta 1000:1 en ciertas especies. En el maíz , esta única célula puede crecer más de 12 pulgadas (30 cm) para atravesar la longitud del pistilo . La maquinaria interna y las interacciones externas que gobiernan la dinámica del crecimiento del tubo polínico están lejos de ser completamente entendidas.
El citoesqueleto de actina ha demostrado ser fundamental para ayudar al crecimiento del tubo polínico. [21] En términos de distribución espacial, los filamentos de actina se organizan en tres estructuras diferentes dentro del tubo polínico. [21] Cada disposición o patrón único contribuye al mantenimiento del crecimiento celular polarizado característico del tubo polínico. En la región apical (el sitio de crecimiento dirigido hacia la punta), los filamentos de actina son menos abundantes, sin embargo, son altamente dinámicos. Además, pequeñas vesículas se acumulan en el ápice, lo que indica que esta región es el sitio de eventos críticos de direccionamiento y fusión de vesículas. Tales eventos son esenciales para regular la velocidad y la dirección del crecimiento del tubo polínico. [22] En la región subapical, los filamentos de actina se organizan en una estructura similar a un collar. El flujo citoplasmático en fuente inversa ocurre en el subápice; la dirección del flujo citoplasmático se invierte y continúa a lo largo de los cables de actina axiales que comprenden el vástago. La región del vástago comprende la parte central del tubo polínico. En esta región, los filamentos de actina están dispuestos en haces axiales de polaridad uniforme, lo que permite el transporte de varios orgánulos y vesículas desde la base del tubo polínico hasta la punta, impulsando el crecimiento general del tubo. [22]
Tanto la distribución espacial como la dinámica del citoesqueleto de actina están reguladas por proteínas de unión a actina (ABP). Para observar experimentalmente los cambios distributivos que tienen lugar en el citoesqueleto de actina durante el crecimiento del tubo polínico, se han utilizado proteínas fluorescentes verdes (GFP). [21] Las GFP se seleccionaron principalmente con fines de visualización dinámica debido al hecho de que proporcionaban un medio eficiente para la obtención de imágenes no invasivas de filamentos de actina en plantas. Entre las diversas GFP empleadas durante la experimentación se encontraban GFP-mTalin, LIM-GFP y GFP-fimbrin/ABD2-GFP. [23] Sin embargo, cada uno de estos marcadores alteraba la estructura natural de los filamentos de actina o los etiquetaba desfavorablemente. Por ejemplo, GFP-mTalin dio lugar a una excesiva acumulación de filamentos y GFP-fimbrin/ABD2-GFP no marcó los filamentos de actina ubicados en las regiones apical o subapical del tubo polínico. [23] En vista de estos inconvenientes, Lifeact-mEGFP ha sido designado como el marcador destacado de elección para los filamentos de actina en el tubo polínico; Lifeact-mEGFP puede detectar las tres disposiciones de filamentos de actina y tiene efectos mínimos en la estructura natural de los filamentos de actina. [23] Lifeact-mEGFP se ha utilizado como marcador para estudiar la dinámica de los filamentos de actina en los tubos polínicos en crecimiento del tabaco, los lirios y la Arabidopsis . [23]
A través de estudios realizados con GFP, se ha confirmado que el estado dinámico de los filamentos de actina ubicados en la región apical es esencial para el crecimiento del tubo polínico. La experimentación de filamentos de actina teñidos con GFP-mTalin ha arrojado resultados que confirman que los filamentos de actina localizados en la punta son altamente dinámicos. [24] Dicha experimentación ha establecido una conexión entre la dinámica de los filamentos de actina localizados en la punta y su papel en la formación de estructuras de actina en la región subapical. [24] Además, la experimentación de filamentos de actina ubicados en la cúpula apical de Arabidopsis indica que los filamentos de actina se producen continuamente a partir de la membrana apical del tubo polínico; la producción de estos filamentos de actina está mediada por forminas . Estos hallazgos han proporcionado evidencia que respalda la teoría de que los filamentos de actina ubicados en la región apical son altamente dinámicos y son el sitio de eventos de direccionamiento y fusión de vesículas. La experimentación con células de hipocótilo etioladas, así como con células en suspensión BY-2, muestra que los filamentos de actina altamente dinámicos producidos a partir de la membrana apical pueden ser reemplazados por eventos de despolarización y corte de filamentos, o pueden moverse desde el ápice hasta el flanco apical, lo que resulta en una menor acumulación de filamentos de actina en la región apical del tubo polínico. [25]
También se llevó a cabo una experimentación de la dinámica de los filamentos de actina en la región de la caña con el uso de GFP. Los hallazgos indicaron que la longitud máxima del filamento en esta región aumentó significativamente y la frecuencia de corte disminuyó significativamente. Estos hallazgos indican que los filamentos de actina ubicados en la región de la caña son relativamente estables en comparación con los filamentos de actina ubicados en las regiones apical y subapical. [25]
Los ABP regulan la organización y la dinámica del citoesqueleto de actina. [25] Como se indicó anteriormente, los filamentos de actina se sintetizan continuamente a partir de la membrana apical. Esto indica la presencia de factores de nucleación de actina anclados a la membrana. A través de la experimentación, se ha teorizado que las forminas son representativas de dichos factores de nucleación de actina. Por ejemplo, se ha identificado a la formina AtFH5 como un importante regulador de la nucleación de filamentos de actina, específicamente para filamentos de actina sintetizados a partir de la membrana apical del tubo polínico. La eliminación genética de AtFH5 resultó en una disminución de la abundancia de filamentos de actina en las regiones apical y subapical del tubo polínico, lo que proporciona más evidencia para apoyar la teoría de que AtFH5 nuclea el ensamblaje de filamentos de actina en las regiones apical y subapical del tubo polínico. [25]
La formina de clase I AtFH3 es otro factor de nucleación de actina. AtFH3 nuclea el ensamblaje de filamentos de actina de los cables longitudinales de actina ubicados en la región del vástago del tubo polínico. Más específicamente, AtFH3 utiliza el complejo actina/profilina para interactuar con el extremo de los filamentos de actina, iniciando así la nucleación de los filamentos de actina. [25]
Se ha dedicado un trabajo extenso a comprender cómo responde el tubo polínico a las señales de guía extracelulares para lograr la fertilización. [26] [19] [27] [28] Los tubos polínicos reaccionan a una combinación de señales químicas, eléctricas y mecánicas durante su viaje a través del pistilo. [29] [30] [31] Sin embargo, no está claro cómo funcionan estas señales externas o cómo se procesan internamente. Además, aún no se han identificado receptores sensoriales para cualquier señal externa. Sin embargo, ya se han identificado varios aspectos como centrales en el proceso de crecimiento del tubo polínico. Los filamentos de actina en el citoesqueleto, la peculiar pared celular , la dinámica de las vesículas secretoras y el flujo de iones , por nombrar algunos, son algunas de las características fundamentales fácilmente identificadas como cruciales, pero cuyo papel aún no se ha dilucidado por completo.
Durante el crecimiento del tubo polínico, los daños en el ADN que surgen deben repararse para que la información genómica masculina se transmita intacta a la siguiente generación. En la planta Cyrtanthus mackenii , el polen maduro bicelular contiene una célula generativa y una célula vegetativa. [32] Los espermatozoides se derivan de la mitosis de la célula generativa durante la elongación del tubo polínico. La célula vegetativa es responsable del desarrollo del tubo polínico. Las roturas de doble cadena en el ADN que surgen parecen repararse eficientemente en la célula generativa, pero no en la célula vegetativa, durante el proceso de transporte al gametofito femenino . [32]
Para que se produzca la fecundación, hay un rápido crecimiento de la punta de los tubos polínicos que lleva los gametos masculinos a los óvulos. Un tubo polínico consta de tres regiones diferentes: el ápice, que es la región de crecimiento, el subápice, que es la región de transición, y el vástago, que actúa como las células vegetales normales con los orgánulos específicos. [33] [34] La región del ápice es donde se produce el crecimiento de la punta y requiere la fusión de vesículas secretoras. Hay principalmente pectina y homogalacturonanos (parte de la pared celular en la punta del tubo polínico) dentro de estas vesículas. [35] La pectina en la región del ápice contiene metilésteres que permiten flexibilidad, antes de que la enzima pectina metilesterasa elimine los grupos metiléster permitiendo que el calcio se una entre las pectinas y dé soporte estructural. [36] Los homogalacturonanos se acumulan en la región del ápice a través de la exocitosis para aflojar la pared celular. Se formará una pared de la punta más gruesa y blanda con una menor capacidad de fluencia, lo que permite la expansión celular, lo que conduce a un aumento del crecimiento de la punta. Durante el crecimiento de la punta se produce una corriente citoplasmática en sentido inverso, que es esencial para la expansión celular, ya que transporta orgánulos y vesículas entre la región del vástago y la región del subápice.
El citoesqueleto de actina es un factor importante en el crecimiento del tubo polínico, porque existen diferentes patrones de citoesqueleto de actina dentro de las diferentes regiones del tubo polínico para el mantenimiento del crecimiento celular polarizado. Por ejemplo, existen cables de actina longitudinales en la región del vástago para regular el flujo citoplasmático de fuente inversa. [37] La F-actina controla la acumulación de vesículas llenas de homogalacturonanos, que esencialmente median el crecimiento de la punta, en la región del subápice. [38] Los filamentos de actina controlan las interacciones de la membrana apical y el citoplasma mientras el tubo polínico está creciendo en la región del ápice. [39] La F-actina de la membrana apical produce una proteína de unión a actina llamada formina, que es esencial para el crecimiento de la punta del tubo polínico. Las forminas se expresan en las células de crecimiento de la punta y se dividen en dos subgrupos: tipo I y tipo II. Las forminas de tipo I producen las estructuras de actina y participan en la citocinesis. Por otra parte, las forminas de tipo II contribuyen al crecimiento de células polarizadas, lo cual es necesario para el crecimiento de la punta. [40] El crecimiento de la punta es una forma de crecimiento polarizado extremo y este proceso polarizado requiere la organización del citoesqueleto de actina mediada por la proteína de unión a la actina. Una proteína esencial necesaria para este crecimiento de la punta es la proteína organizadora de actina y la proteína formina de tipo II llamada Determinante Morfológico de Rice (RMD). El RMD se localiza en la punta del tubo polínico y controla el crecimiento del tubo polínico regulando la polaridad y la organización de la matriz de F-actina. [41] [42]
El RMD promueve la germinación del polen y el crecimiento del tubo polínico, y esto se ha demostrado a través de numerosos experimentos. El primer experimento compara las características del pistilo y el estigma del mutante rmd-1 (planta de arroz sin un RMD funcional) y la planta de arroz de tipo salvaje (con un RMD funcional). La antera y el pistilo eran más cortos en los mutantes rmd-1 que en el tipo salvaje. Este experimento mostró que el RMD es fundamental para el desarrollo del polen. Las plantas de arroz de tipo salvaje tienen mayores tasas de germinación, mientras que los mutantes rmd-1 tienen tasas de germinación reducidas. Esto se observó cuando ambas plantas germinaron en un medio de germinación líquido. Después de probar las tasas de germinación, se realizó una comparación de las longitudes y anchuras de los tubos polínicos entre las dos plantas. Los tubos polínicos de las plantas de tipo salvaje tenían una mayor longitud del tubo polínico que los mutantes, pero los mutantes tenían un mayor ancho del tubo. Este mayor ancho del tubo polínico dentro de los mutantes indica la disminución en el crecimiento de células polarizadas y, por lo tanto, una disminución en el crecimiento de la punta. A continuación, se recogieron los granos de polen del tipo salvaje y de los mutantes para comparar las actividades de polinización entre los tipos salvajes y los mutantes. Se observó una disminución de la actividad y una penetración mínima en los mutantes, mientras que se observó un aumento de la actividad y la penetración a través del estilo y hasta la base de los pistilos en los tipos salvajes. Estas observaciones indicaron un retraso en el crecimiento del tubo polínico en los mutantes rmd-1. Además, no se observó ningún efecto sobre las tasas de fertilización entre el tipo salvaje y el mutante, lo que se comprobó midiendo las tasas de formación de semillas entre el tipo salvaje y el mutante. Se descubrió que ambos tenían tasas de formación de semillas similares. Por lo tanto, el RMD no afecta a la fertilización y solo tiene un efecto sobre el crecimiento de la punta. [42]
Se realizaron extracciones de ARN total de la flor entera, lema, pálea, lodícula, pistilo, antera y granos de polen maduros de las plantas de tipo silvestre para descubrir dónde se expresa específicamente RMD en la planta en su conjunto. Utilizando RT-qPCR (PCR cuantitativa de transcripción inversa), fue evidente que había diferentes cantidades de transcripciones de RMD dentro de cada parte de la planta. Y luego fue evidente dónde estaba presente RMD en cada parte de la planta utilizando RT-PCR (PCR de transcripción inversa) y utilizando UBIQUITIN como control. Estos dos métodos demostraron que había una presencia abundante de las transcripciones de RMD en la lema, el pistilo, la antera y los granos de polen maduros. Para confirmar estos resultados, se realizó otro método. Este método utilizó plantas transgénicas que tenían una región promotora de RMD fusionada con un gen reportero que codifica GUS. [42] La tinción histoquímica de los tejidos de estas plantas transgénicas mostró una alta actividad de GUS en el pistilo, la pared de la antera y los granos de polen maduros. Por lo tanto, estos resultados combinados demostraron que la RMD se expresa en estos órganos específicos de la planta.
Se empleó nuevamente la detección de señales GUS para estudiar dónde se expresa específicamente RMD dentro del tubo polínico. Primero, se recolectaron granos de polen de plantas transgénicas proRMD::GUS y se observó que había una fuerte señal GUS dentro de estos granos de polen maduros. Luego, estos granos de polen se germinaron in vitro y se observaron señales GUS dentro del crecimiento de la punta de los tubos polínicos. Sin embargo, la fuerza de estas señales GUS varió en diferentes etapas de germinación. Las señales GUS fueron débiles dentro de la punta del tubo polínico en la etapa de germinación temprana, pero más fuertes en las etapas de germinación posteriores. Por lo tanto, estos resultados respaldan que RMD está involucrado en la germinación del polen y el crecimiento del tubo polínico.
RMD, que son forminas de tipo II, consisten en un dominio similar a la fosfatasa (PTEN) (responsable de la localización de proteínas), y dominios FH1 y FH2 (promueven la polimerización de actina). [43] [44] [42] Para descubrir la localización de RMD en el tubo polínico, se realizaron ensayos transitorios de tubos polínicos en crecimiento de tabaco y se utilizó la proteína fluorescente-GFP. Se observaron muchas imágenes confocales de varios tubos polínicos en condiciones específicas: pLat52::eGFP (eGFP único impulsado por el promotor Lat52 específico del polen y este actúa como control); pLat52::RMD-eGFP (proteína RMD fusionada con eGFP); pLat52::PTEN-eGFP (el dominio PTEN fusionado con eGFP); y pLat52::FH1FH2-eGFP (los dominios FH1 y FH2 fusionados con eGFP). Al comparar las imágenes del control con pLat52::RMD-eGFP, se observa que el GFP único se distribuyó por todo el tubo, mientras que RMD-eGFP se acumuló en la región de la punta del tubo. Por lo tanto, esto demuestra que RMD se localiza dentro de la punta del tubo polínico.
Para descubrir si el dominio similar a PTEN es responsable de la localización de RMD, se realizó una comparación entre las imágenes confocales de GFP fusionada con el dominio PTEN y RMD acortado sin el dominio PTEN (pLat52::FH1FH2-eGFP). Las señales PTEN-eGFP se localizaron en la punta de los tubos polínicos como las señales RMD-eGFP, mientras que las señales FH1FH2-eGFP estaban presentes en todo el tubo polínico y no se localizaron de manera polar. Por lo tanto, estos resultados combinados demuestran que el dominio similar a PTEN es responsable de la localización de RMD en la punta de los tubos polínicos.
Para determinar si el RMD controla la organización de la F-actina dentro del tubo polínico, se observaron las formaciones de F-actina en los granos de polen maduros de tipo salvaje y rmd-1 utilizando la tinción Alexa Fluor 488-faloidina. Se observaron filamentos de actina fuertemente agrupados alrededor de las aberturas de los granos de polen de tipo salvaje, aunque no hubo acumulación de filamentos de actina alrededor de las aberturas en los granos de polen rmd-1. Además, hubo señales débiles y una organización aleatoria de los filamentos de actina dentro del grano de polen rmd-1. Por lo tanto, estos resultados respaldan que el RMD es esencial para controlar la germinación del polen.
La intensidad de fluorescencia se midió mediante análisis estadístico para observar las densidades de filamentos de actina dentro de los tubos polínicos. [45] Hubo una mayor intensidad de fluorescencia en la región del vástago de los tubos mutantes rmd, lo que significa que hubo una mayor densidad de F-actina dentro de esta región. Pero, se observó una menor densidad de F-actina en la región de la punta de los tubos mutantes rmd en comparación con los tubos de tipo salvaje. Esto demuestra que el patrón de distribución de F-actina de los tubos polínicos se altera sin un RMD funcional.
Para determinar la polaridad de los cables de actina, se midieron los ángulos entre los cables de actina y el eje de elongación del tubo polínico. Los ángulos en la región del vástago de los tubos polínicos de tipo salvaje fueron predominantemente menores de 20°, mientras que los ángulos para los tubos polínicos mutantes rmd fueron mayores de 60°. Estos resultados respaldan el hecho de que el RMD es esencial para el crecimiento polarizado de la punta, porque los tubos polínicos mutantes rmd (sin un RMD funcional) exhibieron un mayor ancho y, por lo tanto, una disminución en el crecimiento de la punta. También se midió la longitud máxima de los cables individuales de filamentos de F-actina desde la región apical hasta la del vástago de los tubos polínicos en elongación para probar la polaridad dentro del tubo polínico. La longitud máxima de los cables de F-actina fue más corta en los tubos polínicos mutantes rmd en comparación con los de los tubos de tipo salvaje. Por lo tanto, estos resultados combinados respaldan que la organización adecuada de los cables de actina, así como las densidades normales de F-actina dentro de la punta del tubo, solo se pueden lograr si está presente RMD.
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