Un ARN de horquilla corta o ARN de horquilla pequeña ( shRNA /vector de horquilla) es una molécula de ARN artificial con una curva de horquilla apretada que se puede utilizar para silenciar la expresión de genes objetivo a través de interferencia de ARN (RNAi). [1] [2] La expresión de shRNA en células se logra típicamente mediante la administración de plásmidos o a través de vectores virales o bacterianos . El shRNA es un mediador ventajoso de RNAi ya que tiene una tasa relativamente baja de degradación y recambio. Sin embargo, requiere el uso de un vector de expresión , que tiene el potencial de causar efectos secundarios en aplicaciones medicinales. [3]
La elección del promotor es esencial para lograr una expresión robusta del shRNA. Al principio, se utilizaban promotores de la polimerasa III , como U6 y H1; sin embargo, estos promotores carecen de control espacial y temporal. [3] Por ello, se ha producido un cambio hacia el uso de promotores de la polimerasa II , que son inducibles, para regular la expresión del shRNA.
La expresión de shRNA en células se puede obtener mediante la administración de plásmidos o a través de vectores virales o bacterianos .
La administración de plásmidos a las células mediante transfección para obtener la expresión de ARNsh se puede lograr utilizando reactivos disponibles comercialmente in vitro . Sin embargo, este método no es aplicable in vivo y, por lo tanto, tiene una utilidad limitada.
El uso de un vector bacteriano para obtener la expresión de shRNA en células es un enfoque relativamente reciente. Se basa en investigaciones que muestran que la Escherichia coli recombinante , que contiene un plásmido con shRNA, administrada a ratones puede inhibir la expresión de genes diana en el epitelio intestinal. [4] Este enfoque se utilizó en 2012 en ensayos clínicos para intentar tratar a pacientes con poliposis adenomatosa familiar. [5]
Se puede utilizar una variedad de vectores virales para obtener la expresión de shRNA en células, incluidos los virus adenoasociados (AAV), adenovirus y lentivirus . Con los virus adenoasociados y los adenovirus, los genomas permanecen episomales. Esto es ventajoso ya que se evita la mutagénesis insercional. Es desventajoso porque la progenie de la célula perderá el virus rápidamente a través de la división celular a menos que la célula se divida muy lentamente. Los AAV se diferencian de los adenovirus en que se han eliminado los genes virales y tienen una capacidad de empaquetamiento disminuida. Los lentivirus se integran en secciones de cromatina transcripcionalmente activa y, por lo tanto, se transmiten a las células de la progenie. Con este enfoque, existe un mayor riesgo de mutagénesis insercional; sin embargo, el riesgo se puede reducir utilizando un lentivirus deficiente en integrasa. [6]
Una vez que el vector se ha integrado en el genoma del huésped, el shRNA se transcribe en el núcleo por la polimerasa II o la polimerasa III, según la elección del promotor. El producto imita al pri-microRNA (pri-miRNA) y es procesado por Drosha . El pre-shRNA resultante es exportado desde el núcleo por Exportin 5. Este producto es procesado por Dicer y cargado en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). La hebra sentido (pasajera) se degrada. La hebra antisentido (guía) dirige al RISC al ARNm que tiene una secuencia complementaria. En el caso de complementariedad perfecta, el RISC escinde el ARNm. En el caso de complementariedad imperfecta, el RISC reprime la traducción del ARNm. En ambos casos, el shRNA conduce al silenciamiento del gen diana.
Debido a la capacidad del ARNsh de proporcionar un silenciamiento genético específico y duradero, ha habido un gran interés en su uso para aplicaciones de terapia génica. A continuación se analizan tres ejemplos de terapias basadas en ARNsh.
Gradalis, Inc. desarrolló la vacuna FANG, que se utiliza en el tratamiento de cánceres avanzados. FANG se basa en un ARNsh bifuncional (bi-shRNA) contra los factores de crecimiento transformantes (TGF) inmunosupresores β1 y β2. [8] Se extrajeron células tumorales autólogas de los pacientes y se introdujo ex vivo un plásmido que codifica el ARNsh bifuncional y el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GMCSF) mediante electroporación. Estas células se irradiaron posteriormente y se inyectaron nuevamente en el paciente.
Marina Biotech desarrolló CEQ508, que se utiliza para tratar la poliposis adenomatosa familiar. CEQ508 utiliza un vector bacteriano para administrar ARNhc contra la β-catenina.
Gradalis, Inc. desarrolló el shRNA-STMN1 bifuncional (pbi-shRNA STMN1), que se utiliza para tratar cánceres avanzados y/o metastásicos. Este pbi-shRNA STMN1 actúa contra la estatmina 1 y se administra por vía intratumoral a través de la tecnología de lipoplex (LP) de vesículas invaginadas bilaminares (BIV) .
Los tratamientos basados en shRNA suelen enfrentarse a diversos desafíos. El más importante es su administración. El shRNA se administra normalmente mediante el uso de un vector y, aunque por lo general son eficaces, plantean importantes problemas de seguridad. En particular, los métodos de terapia génica basados en virus han demostrado ser peligrosos en ensayos clínicos anteriores. En la primera generación de terapia génica retroviral, algunos pacientes tratados con vectores virales para el síndrome de Wiskott-Aldrich desarrollaron leucemia aguda de células T. Se determinó que esto se debía a la ubicación de la inserción del vector viral. [9] La posible sobresaturación de RISC también es un problema. Si el shRNA se expresa en niveles demasiado altos, la célula podría no ser capaz de procesar correctamente el ARN endógeno, lo que podría causar problemas importantes. Otro desafío es la posibilidad de que el paciente genere una respuesta inmunitaria contra la terapia. [10] Por último, podría haber efectos no deseados y el shRNA podría silenciar otros genes no deseados. Al desarrollar nuevos tratamientos exitosos basados en shRNA, se deben tener en cuenta todos estos desafíos.