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El fraccionamiento por flujo de campo , abreviado FFF , [1] es una técnica de separación inventada por J. Calvin Giddings . La técnica se basa en la separación de sustancias coloidales o de alto peso molecular en soluciones líquidas, que fluyen a través de la plataforma de separación, que no tiene una fase estacionaria . Es similar a la cromatografía líquida, ya que trabaja sobre soluciones diluidas o suspensiones del soluto, transportadas por un eluyente que fluye. La separación se logra aplicando un campo (hidráulico, centrífugo, [2] térmico, [3] eléctrico, [4] magnético, [5] gravitacional, ...) o de flujo cruzado, perpendicular a la dirección de transporte de la muestra, que se bombea a través de un canal laminar largo y estrecho. El campo ejerce una fuerza sobre los componentes de la muestra, concentrándolos hacia una de las paredes del canal, que se llama pared de acumulación. [6] La fuerza interactúa con una propiedad de la muestra, con lo que se produce la separación, en otras palabras, los componentes muestran diferentes "movilidades" bajo la fuerza ejercida por el campo de cruce. Por ejemplo, en el caso del método hidráulico o de flujo cruzado, la propiedad que determina la separación es el coeficiente de difusión traslacional o el tamaño hidrodinámico. En el caso de un campo térmico (que calienta una pared y enfría la otra), es la relación entre el coeficiente de difusión térmica y el coeficiente de difusión traslacional.
La FFF es aplicable en el rango submicrónico (desde 1 nm hasta varios micrones) en el modo "normal" o hasta 50 micrones en el llamado modo estérico [7] [8] . La transición del modo normal al estérico tiene lugar cuando la difusión se vuelve insignificante en tamaños superiores a un micrón . La FFF es única en su amplio rango dinámico de tamaños que abarca tanto macromoléculas solubles [9] como partículas o coloides que se pueden separar en un análisis.
Las aplicaciones típicas son polímeros de alta masa molar y compuestos poliméricos, nanopartículas , tanto industriales como ambientales, virus y partículas similares a virus, nanopartículas lipídicas, vesículas extracelulares y otros tipos de muestras biológicas.
La FFF se puede acoplar a todos los tipos de detectores conocidos de HPLC o SEC. Debido a la similitud de la FFF con la cromatografía líquida, en cuanto a la forma en que pasa una fase móvil líquida a través del canal, los detectores más comunes son los que también se utilizan para LC. El detector más utilizado es el UV-VIS, debido a su naturaleza no destructiva. El acoplamiento con la dispersión de luz multiángulo permite calcular el tamaño de las fracciones de elución y compararlas con los valores obtenidos mediante la teoría de la FFF. Otra detección específica popular es la espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente para caracterizar nanopartículas metálicas con alta especificidad y sensibilidad.
La FFF ofrece una separación física de muestras complejas y no homogéneas, que potencialmente no pueden caracterizarse mediante otros métodos de separación, como la cromatografía de exclusión por tamaño . Debido a que no hay una fase estacionaria, hay menos interacción con las superficies o los materiales de relleno de la columna. La separación se puede ajustar modulando la fuerza del campo de separación. La FFF es un método suave y no ejerce tensión física sobre las muestras frágiles, y la solución portadora se puede adaptar en vista de la mejor estabilidad de la muestra. La FFF tiene una teoría bien elaborada, que se puede utilizar para encontrar las condiciones de separación para alcanzar el resultado óptimo, sin una serie de experimentos de prueba y error. También es posible extraer información de los parámetros físicos de las fracciones de muestra de la teoría FFF, aunque casi todos los usuarios dependen principalmente de los detectores de dispersión de luz para medir el tamaño de las fracciones de muestra eluidas.
La FFF no funciona con moléculas pequeñas debido a su rápida difusión. Para lograr una separación eficaz, la muestra debe estar concentrada muy cerca de la pared de acumulación (a una distancia inferior a 10 μm), lo que requiere que la velocidad de deriva causada por el campo de fuerza sea dos órdenes de magnitud mayor en comparación con el coeficiente de difusión. La intensidad máxima del campo que se puede generar en un canal FFF determina el rango de tamaño inferior de separación. Para la instrumentación actual, esto es aproximadamente 1 nm.
Aunque la FFF es una técnica extremadamente versátil, no existe un método "universal" para todas las aplicaciones. Los distintos métodos de FFF necesitan instrumentación especializada. Actualmente, solo el denominado fraccionamiento asimétrico de flujo en campo (AF4) [10] ha ganado un uso generalizado. Otros métodos, como la FFF centrífuga, térmica o eléctrica, aún tienen una existencia limitada.
La FFF se comporta de manera diferente a la cromatografía en columna y puede resultar contraintuitiva para los usuarios de HPLC o SEC. Comprender el principio de funcionamiento de la FFF es fundamental para una aplicación exitosa del método.
La FFF fue ideada y publicada por primera vez por J. Calvin Giddings en 1966 [11] y en 1976 [1]. Giddings había publicado muchos artículos sobre Flow-FFF [12] , que es la técnica de FFF más importante en la actualidad. Giddings, a quien se le atribuye la invención de la FFF, fue profesor de química y especialista en cromatografía y técnicas de separación en la Universidad de Utah .
Como se mencionó anteriormente, en el fraccionamiento de flujo de campo, el campo puede ser hidráulico (con un flujo cruzado a través de una membrana semipermeable como pared de acumulación), gravitacional , centrífugo , térmico , eléctrico o magnético . En todos los casos, el mecanismo de separación se produce por diferencias en la movilidad de las partículas bajo las fuerzas del campo, en un equilibrio estacionario con las fuerzas de difusión : el campo induce una velocidad de deriva descendente y una concentración hacia la pared de acumulación, la difusión trabaja contra este gradiente de concentración. Después de un cierto tiempo (llamado tiempo de relajación), las dos fuerzas se equilibran en un equilibrio estacionario. Esto se visualiza mejor como una nube de partículas, con todos los componentes en movimiento constante, pero con una disminución exponencial de la concentración promedio que se aleja de la pared de acumulación hacia el canal. La disminución de la presión del aire que sube desde el nivel del mar tiene la misma disminución exponencial que se describe en la fórmula barométrica . Una vez que se ha logrado la relajación, la elución comienza a medida que se activa el flujo del canal. En el canal delgado (altura típica de 250 a 350 μm) existe un perfil de velocidad de flujo laminar parabólico , que se caracteriza por un fuerte aumento de la velocidad de flujo con el aumento de la distancia desde la pared de acumulación. Esto determina la velocidad de una partícula particular, en función de su posición de equilibrio desde la pared del canal. Las partículas más cercanas a la pared de acumulación migrarán más lentamente en comparación con otras que estén más arriba. La relación entre la velocidad de una especie de partícula y la velocidad promedio del fluido se denomina relación de retención R . En FFF para una separación eficiente, R debe ser inferior a 0,2; los valores típicos están en el rango de 0,02 a 0,1.
La separación en el fraccionamiento por flujo de campo se lleva a cabo en un canal laminar. Está compuesto por un bloque superior y otro inferior que están separados por un espaciador. El espaciador tiene un hueco recortado (rectangular o trapezoidal), que crea el volumen del canal a medida que el espaciador está sellado entre los bloques. Alternativamente, el canal se puede fresar en el bloque superior como una cavidad. El canal está diseñado de manera que permita la aplicación del campo de fuerza, lo que significa que para cada método FFF se necesita un canal dedicado. La muestra se inyecta en una solución o suspensión diluida en el canal y se separa durante la migración desde la entrada a la salida a medida que la solución portadora se bombea a través del canal. Aguas abajo de la salida del canal se colocan uno o varios detectores que analizan las fracciones eluidas.
Giddings y sus colaboradores han desarrollado una teoría que describe la ecuación de retención general que es común a todos los métodos FFF.
La relación entre el campo de fuerza de separación y el tiempo de retención se puede derivar de los primeros principios. Consideremos dos poblaciones de partículas dentro del canal FFF. El campo cruzado impulsa ambas nubes de partículas hacia la pared de "acumulación" inferior. En oposición a este campo de fuerza se encuentra la difusión natural de las partículas, o movimiento browniano , que produce un movimiento contrario. Cuando estos dos procesos de transporte alcanzan el equilibrio, la concentración de partículas c se aproxima a la función exponencial de la elevación x por encima de la pared de acumulación, como se ilustra en la ecuación ( 1 ).
representa la elevación característica de la nube de partículas. Esto se relaciona con la altura promedio que alcanza la nube de partículas dentro del canal y solo cuando el valor de es diferente para las poblaciones de partículas se producirá la separación. La de cada componente puede estar relacionada con la fuerza aplicada sobre cada partícula individual o con la relación entre el coeficiente de difusión D y la velocidad de deriva U. [13]
k es la constante de Boltzmann, T es la temperatura absoluta y F es la fuerza ejercida sobre una partícula individual por el campo de fuerza. Esto muestra cómo el valor característico de elevación es inversamente dependiente de la fuerza aplicada. Por lo tanto, F gobierna el proceso de separación. Por lo tanto, al variar la intensidad del campo, se puede controlar la separación para lograr niveles óptimos.
La velocidad V de una nube de moléculas es simplemente la velocidad promedio de una distribución exponencial incrustada en un perfil de flujo parabólico.
El tiempo de retención, t r se puede escribir como:
Donde L es la longitud del canal.
En FFF, la retención se expresa generalmente en términos de la relación de retención, que es el tiempo de vacío t 0 (aparición de un trazador no retenido) dividido por el tiempo de retención t r . La ecuación de retención se convierte entonces en:
donde se divide por w, el espesor o la altura del canal. Sustituyendo kT/F en lugar de se ilustra la relación de retención con respecto a la fuerza transversal aplicada.
Para que el funcionamiento sea eficiente, el valor del espesor del canal w supera ampliamente a . Cuando este es el caso, el término entre paréntesis se aproxima a la unidad. Por lo tanto, la ecuación 5 puede aproximarse a:
Por lo tanto, t r es aproximadamente proporcional a F. La separación de las bandas de partículas X e Y, representada por el incremento finito ∆t r en sus tiempos de retención, se logra solo si el incremento de fuerza ∆F entre ellas es suficiente. Para que esto sea así, se requiere una diferencia de fuerza de solo 10 −16 N.
La magnitud de F y ∆F dependen de las propiedades de las partículas, la intensidad del campo y el tipo de campo. Esto permite variaciones y adaptaciones de la técnica. A partir de este principio básico han evolucionado muchas formas de FFF que varían según la naturaleza de la fuerza de separación aplicada y el rango de tamaño de las moléculas a las que están dirigidas.
En la FFF, la representación de las señales del detector en función del tiempo se denomina fractograma, a diferencia del cromatograma de las técnicas de cromatografía en columna. El fractograma se puede convertir en un gráfico de distribución de una o varias propiedades físicas del analito utilizando la teoría FFF y/o las señales del detector. Puede tratarse de tamaño, masa molar, carga, etc.
A menudo, estas sustancias son partículas suspendidas inicialmente en un pequeño volumen de un tampón líquido y empujadas a lo largo del canal FFF por el tampón. Las velocidades variables de una especie particular de partículas pueden deberse a su tamaño, su masa y/o su distancia a las paredes de un canal con velocidad de flujo no uniforme. La presencia de diferentes especies en una muestra puede identificarse mediante la detección de una propiedad común a cierta distancia a lo largo del canal largo y mediante el fractograma resultante que indica la presencia de las diversas especies mediante picos, debido a los diferentes tiempos de llegada característicos de cada especie y sus propiedades físicas y químicas.
La mayoría de las técnicas disponibles hoy en día son avances de las creadas originalmente por el profesor Giddings hace casi cuatro décadas.
De estas técnicas, la primera que se comercializó fue la FFF de flujo. La FFF de flujo separa partículas en función de su tamaño, independientemente de la densidad, y puede medir macromoléculas en el rango de 1 nm a 1 μm. En este sentido, es la subtécnica de FFF más versátil disponible. El flujo cruzado en la FFF de flujo entra a través de una frita porosa en la parte superior del canal y sale a través de una frita de salida de membrana semipermeable en la pared de acumulación (es decir, la pared inferior). El flujo simétrico ha sido reemplazado por el flujo asimétrico en las últimas dos décadas.
La FFF de flujo de fibra hueca (HF5) fue desarrollada por Lee et al . (1974). [14] La HF5 se ha aplicado al análisis de proteínas y otras macromoléculas. La HF5 fue la primera forma de FFF de flujo que se desarrolló en 1974. La ventaja es que la HF5 ofrece una unidad de canal desechable que se puede reemplazar fácilmente en aplicaciones de rutina. Una de las desventajas de la HF5 es la elección limitada de materiales de membrana; solo están disponibles membranas de poliéter sulfona (PES). Actualmente, la HF5 no se usa ampliamente debido a la falta de flexibilidad y las limitaciones en la carga de muestra.
Por otro lado, el flujo asimétrico FFF ( AF4 ) tiene solo una membrana semipermeable en la pared inferior del canal. Por lo tanto, el flujo cruzado se crea cuando el líquido portador sale por el fondo del canal. Esto ofrece una separación extremadamente suave y un rango de separación "ultra amplio". La mayoría de los instrumentos FFF en uso son sistemas AF4. Las principales aplicaciones son en la investigación y el desarrollo farmacéutico de proteínas, virus y partículas similares a virus y liposomas. El AF4 se puede aplicar en disolventes acuosos y orgánicos, por lo que también se pueden separar polímeros orgánicos mediante esta técnica.
El fraccionamiento de campo de flujo asimétrico de alta temperatura está disponible para la separación de polímeros de masa molar alta y ultra alta solubles a temperaturas superiores a 150 C.
La FFF térmica, como sugiere su nombre, establece una fuerza de separación mediante la aplicación de un gradiente de temperatura al canal. La pared superior del canal se calienta y la pared inferior se enfría, impulsando los polímeros y las partículas hacia la pared fría mediante difusión térmica. La FFF térmica se desarrolló como una técnica para separar polímeros sintéticos en disolventes orgánicos. La FFF térmica es única entre las técnicas de FFF porque puede separar macromoléculas tanto por masa molar como por composición química, lo que permite la separación de fracciones de polímeros con el mismo peso molecular. Hoy en día, esta técnica es ideal para la caracterización de polímeros, geles y nanopartículas.
Una de las principales ventajas de la FFF térmica es la sencillez y la definición muy clara de las dimensiones del canal de separación, lo que hace posible la calibración universal entre laboratorios o entre instrumentos, ya que las constantes de calibración de la FFF térmica describen con precisión la relación entre el coeficiente de difusión (molecular) ordinario D y el coeficiente de difusión térmica (o movilidad termoforética) D T , que dependen únicamente del polímero. Por lo tanto, la calibración universal de la FFF térmica es transferible entre instrumentos y laboratorios, mientras que la conocida calibración universal de cromatografía de exclusión por tamaño es transferible entre polímeros únicamente en el mismo instrumento. [15]
El fraccionamiento de celdas delgadas con flujo dividido (SPLITT) [16] es una técnica especial de FFF preparativa que utiliza la gravedad [17] o la electricidad [18] o diferencias de difusión para la separación de partículas de tamaño superior a μm de forma continua. El sistema SPLITT tiene dos entradas y dos salidas. Se realiza bombeando la muestra sumergida en un líquido en una entrada al comienzo del canal a un caudal bajo, mientras que simultáneamente se bombea un líquido portador en la segunda entrada a un caudal mucho mayor. Al controlar las relaciones de caudal de las dos corrientes de entrada y las dos corrientes de salida, se puede controlar la separación y los componentes de la muestra se separan en dos fracciones de tamaño distinto. El uso de la gravedad únicamente como fuerza de separación hace que SPLITT sea la técnica de FFF menos sensible, limitada a partículas de más de 1 μm.
En la FFF centrífuga, el campo de separación se genera mediante una fuerza centrífuga. El canal adopta la forma de un anillo, que gira a velocidades de rotación que se pueden programar durante el proceso. El flujo y la muestra se bombean al canal y se centrifugan, lo que permite al operador resolver las partículas por masa (tamaño y densidad). La ventaja de la FFF centrífuga radica en la alta resolución de tamaño que se puede lograr al variar la fuerza aplicada, ya que el tamaño de las partículas es proporcional a la masa de las partículas a la tercera potencia.
La ventaja única que presenta la FFF centrífuga proviene de la capacidad de las técnicas para lograr una alta resolución si se cuenta con una densidad de flotación suficiente. Esto permite la separación de partículas con una diferencia de tamaño de solo el 5 %.
La FFF centrífuga tiene la ventaja de que las partículas y las macromoléculas se pueden separar por densidad de partículas, en lugar de solo por tamaño de partículas. En este caso, dos nanopartículas de oro y plata de tamaño idéntico se pueden separar en dos picos, según las diferencias de densidad en las nanopartículas de oro y plata.
En las separaciones AF4, la relación entre masa y tiempo es de 1:1. Si se añade el tercer parámetro, la densidad, a la FFF centrífuga, se obtiene una relación más parecida a la de masa:tiempo elevada a la tercera potencia. Esto da como resultado una distinción significativamente mayor entre picos y una resolución muy mejorada. Esto puede resultar especialmente útil para productos novedosos, como materiales compuestos y polímeros recubiertos que contienen nanopartículas, es decir, partículas que pueden no variar en tamaño pero que sí varían en densidad. De esta forma, dos partículas de tamaño idéntico se pueden separar en dos picos, siempre que la densidad sea diferente.
La limitación del método reside en el límite inferior de tamaño, que depende de la densidad de la muestra. En el caso concreto de las muestras biológicas, el límite se sitúa en el orden de los 20 a 50 nm de diámetro.
En la FFF eléctrica se aplica una corriente eléctrica transversal (CC) que crea un campo eléctrico. Dependiendo de la carga de los componentes de la muestra, se induce una velocidad de deriva electroforética , contrarrestada por la difusión del movimiento browniano, por lo que la separación depende de la relación entre la movilidad electroforética y el tamaño. La aplicación de la FFF eléctrica ha sido limitada y actualmente se utiliza raramente. Se han desarrollado otras modificaciones, a saber, la FFF eléctrica cíclica, en la que se aplica una corriente alterna especial. Permite separar según la movilidad electroforética. Otra variación es la FFF de flujo asimétrico eléctrico (EAF4), en la que se aplica un campo eléctrico además de un campo de flujo cruzado. La EAF4 supera la limitación de la FFF eléctrica pura, que tiene una resolución deficiente y sufre de productos de electrólisis y burbujas que contaminan el flujo de salida del canal y comprometen las señales del detector. [19]
