El ensayo de proteínas de Bradford (también conocido como ensayo de proteínas de Coomassie) fue desarrollado por Marion M. Bradford en 1976. [1] Es un procedimiento analítico espectroscópico rápido y preciso [2] que se utiliza para medir la concentración de proteínas en una solución. La reacción depende de la composición de aminoácidos de las proteínas medidas.
El ensayo de Bradford, un ensayo colorimétrico de proteínas , se basa en un cambio de absorbancia del colorante azul brillante de Coomassie G-250 . El colorante azul brillante de Coomassie G-250 existe en tres formas: aniónica (azul), neutra (verde) y catiónica (roja). [3] En condiciones ácidas, la forma roja del colorante se convierte en su forma azul, uniéndose a la proteína que se está ensayando. Si no hay proteína a la que unirse, la solución permanecerá marrón. El colorante forma un complejo fuerte, no covalente con el grupo carboxilo de la proteína por la fuerza de van der Waals y el grupo amino a través de interacciones electrostáticas. [1] Durante la formación de este complejo, la forma roja del colorante de Coomassie primero dona su electrón libre a los grupos ionizables de la proteína, lo que causa una alteración del estado nativo de la proteína, exponiendo en consecuencia sus bolsillos hidrófobos . Estos bolsillos en la estructura terciaria de la proteína se unen de forma no covalente a la región no polar del colorante a través de la primera interacción de enlace ( fuerzas de van der Waals ), que coloca los grupos amino positivos en proximidad con la carga negativa del colorante. El enlace se fortalece aún más mediante la segunda interacción de enlace entre los dos, la interacción iónica. Cuando el colorante se une a la proteína, provoca un cambio de 465 nm a 595 nm, por lo que las lecturas de absorbancia se toman a 595 nm. [4]
La forma catiónica (no unida) es verde/roja y tiene un espectro de absorción máximo que históricamente se ha considerado a 465 nm . La forma aniónica unida del colorante, que se mantiene unida mediante interacciones hidrofóbicas e iónicas, tiene un espectro de absorción máximo que históricamente se ha considerado a 595 nm . [5] El aumento de la absorbancia a 595 nm es proporcional a la cantidad de colorante unido y, por lo tanto, a la cantidad (concentración) de proteína presente en la muestra. [6]
A diferencia de otros ensayos de proteínas, el ensayo de proteínas de Bradford es menos susceptible a la interferencia de varios compuestos químicos como sodio, potasio o incluso carbohidratos como la sacarosa, que pueden estar presentes en las muestras de proteínas. [2] Una excepción a destacar son las concentraciones elevadas de detergente . El dodecil sulfato de sodio (SDS), un detergente común, se puede encontrar en extractos de proteínas porque se usa para lisar células al alterar la bicapa lipídica de la membrana y para desnaturalizar proteínas para SDS-PAGE . Mientras que otros detergentes interfieren con el ensayo a alta concentración, la interferencia causada por SDS es de dos modos diferentes, y cada uno ocurre a una concentración diferente. Cuando las concentraciones de SDS están por debajo de la concentración micelar crítica (conocida como CMC, 0,00333% P/V a 0,0667%) en una solución de colorante Coomassie, el detergente tiende a unirse fuertemente con la proteína, inhibiendo los sitios de unión de proteínas para el reactivo de colorante. Esto puede causar subestimaciones de la concentración de proteína en solución. Cuando las concentraciones de SDS son superiores a las de CMC, el detergente se asocia fuertemente con la forma verde del colorante Coomassie, lo que hace que el equilibrio se desplace y produzca más de la forma azul. Esto provoca un aumento de la absorbancia a 595 nm independientemente de la presencia de proteínas. [6]
Otra interferencia puede provenir del tampón utilizado al preparar la muestra de proteína. Una concentración alta de tampón provocará una sobrestimación de la concentración de proteína debido a la pérdida de protones libres de la solución por la base conjugada del tampón. Esto no será un problema si se utiliza una concentración baja de proteína (posteriormente, el tampón). [6]
Para medir la absorbancia de un compuesto incoloro se debe realizar un ensayo de Bradford. Algunos compuestos incoloros como las proteínas se pueden cuantificar a una densidad óptica de 280 nm debido a la presencia de anillos aromáticos como el triptófano, la tirosina y la fenilalanina, pero si ninguno de estos aminoácidos está presente, la absorción no se puede medir a 280 nm. [7]
Muchas soluciones que contienen proteínas tienen la absorción más alta a 280 nm en el espectrofotómetro, el rango UV. Esto requiere espectrofotómetros capaces de medir en el rango UV, lo que muchos no pueden. Además, la absorción máxima a 280 nm requiere que las proteínas contengan aminoácidos aromáticos como tirosina (Y), fenilalanina (F) y/o triptófano (W). No todas las proteínas contienen estos aminoácidos, un hecho que distorsionará las mediciones de concentración. Si hay ácidos nucleicos presentes en la muestra, también absorberían luz a 280 nm, distorsionando aún más los resultados. Al utilizar el ensayo de proteínas de Bradford, se pueden evitar todas estas complicaciones simplemente mezclando las muestras de proteínas con el colorante azul brillante de Coomassie G-250 (reactivo de Bradford) y midiendo sus absorbancias a 595 nm, que está en el rango visible [8] y puede medirse con precisión mediante el uso de una cámara de teléfono inteligente móvil. [9]
El procedimiento para el ensayo de proteínas de Bradford es muy fácil y sencillo de seguir. Se realiza en un solo paso, donde el reactivo de Bradford se añade a un tubo de ensayo junto con la muestra. Después de mezclar bien, la mezcla cambia casi inmediatamente a un color azul. Cuando el colorante se une a las proteínas a través de un proceso que tarda unos 2 minutos, se produce un cambio en el máximo de absorción del colorante de 465 nm a 595 nm en soluciones ácidas. [2] Además, la unión de proteínas desencadena una reacción metacromática, evidenciada por la aparición de una especie que absorbe la luz alrededor de 595 nm, indicativa de la forma no protonada [10]. Este colorante crea fuertes enlaces no covalentes con las proteínas, a través de interacciones electrostáticas con los grupos amino y carboxilo, así como interacciones de Van Der Waals. Solo las moléculas que se unen a las proteínas en solución exhiben este cambio en la absorción, lo que elimina la preocupación de que las moléculas no unidas del colorante puedan contribuir a la lectura de absorción obtenida experimentalmente. Este proceso es más beneficioso porque es menos costoso que otros métodos, es fácil de usar y tiene una alta sensibilidad del tinte para las proteínas. [11]
Después de 5 minutos de incubación, la absorbancia se puede leer a 595 nm utilizando un espectrofotómetro o una cámara de un teléfono inteligente móvil (método RGBradford). [9]
Este ensayo es uno de los ensayos más rápidos que se realizan en proteínas. [12] El tiempo total que lleva preparar y completar el ensayo es menos de 30 minutos. [13] Todo el experimento se realiza a temperatura ambiente.
El ensayo de proteínas de Bradford puede medir cantidades de proteína tan pequeñas como 1 a 20 μg. [14] Es una técnica extremadamente sensible.
El reactivo colorante es un producto estable, listo para usar, preparado en ácido fosfórico . Puede permanecer a temperatura ambiente hasta 2 semanas antes de que comience a degradarse.
Las muestras de proteínas suelen contener sales, disolventes, tampones, conservantes, agentes reductores y agentes quelantes de metales. Estas moléculas se utilizan con frecuencia para solubilizar y estabilizar las proteínas. Otros ensayos de proteínas como BCA y Lowry son ineficaces porque las moléculas como los agentes reductores interfieren con el ensayo. [15] El uso de Bradford puede ser ventajoso frente a estas moléculas porque son compatibles entre sí y no interferirán. [16]
El gráfico lineal adquirido del ensayo (absorbancia versus concentración de proteína en μg/mL) se puede extrapolar fácilmente para determinar la concentración de proteínas utilizando la pendiente de la línea.
Se trata de una técnica sensible y muy sencilla: se mide la DO a 595 nm tras 5 minutos de incubación. Este método también puede hacer uso de un espectrofotómetro Vis [17] o de la cámara de un teléfono móvil (método RGBradford). [9]
El ensayo de Bradford es lineal en un rango corto, generalmente de 0 μg/mL a 2000 μg/mL, por lo que a menudo es necesario diluir una muestra antes del análisis. Al realizar estas diluciones, el error en una dilución se acumula en diluciones posteriores, lo que da como resultado una relación lineal que puede no ser siempre precisa.
Las condiciones básicas y los detergentes, como el SDS, pueden interferir con la capacidad del colorante de unirse a la proteína a través de sus cadenas laterales. [12]
Los reactivos de este método tienden a teñir los tubos de ensayo. No se pueden utilizar los mismos tubos de ensayo, ya que la tinción afectaría la lectura de absorbancia. Este método también es sensible al tiempo. Cuando se prueba más de una solución, es importante asegurarse de que cada muestra se incube durante la misma cantidad de tiempo para una comparación precisa. [18]
Un factor limitante en el uso de colorantes de determinación de proteínas basados en Coomassie se deriva de la variación significativa en el rendimiento de color observado en diferentes proteínas [19]. Este factor limitante es notablemente evidente en muestras de proteínas ricas en colágeno, como los extractos pancreáticos, donde los métodos de Lowry y Bradford tienden a subestimar el contenido de proteínas.
También se inhibe por la presencia de detergentes, aunque este problema se puede aliviar con la adición de ciclodextrinas a la mezcla de ensayo. [20]
Gran parte de la no linealidad se debe al equilibrio entre dos formas diferentes del colorante, que se altera al añadir la proteína. El ensayo de Bradford linealiza midiendo la relación de las absorbancias, 595 sobre 450 nm. Este ensayo de Bradford modificado es aproximadamente 10 veces más sensible que el convencional. [21]
El colorante azul de Coomassie G250 utilizado para unirse a las proteínas en el método Bradford original se une fácilmente a los grupos arginina y lisina de las proteínas. Esto es una desventaja porque la preferencia del colorante para unirse a estos aminoácidos puede dar como resultado una respuesta variada del ensayo entre diferentes proteínas. Se han realizado cambios en el método original, como aumentar el pH agregando NaOH o agregar más colorante para corregir esta variación. Aunque estas modificaciones dan como resultado un ensayo menos sensible, un método modificado se vuelve sensible a los detergentes que pueden interferir con la muestra. [22]
Se están realizando nuevas modificaciones para mejorar el ensayo de proteínas de Bradford, que se centra específicamente en mejorar la precisión de detección de las proteínas de colágeno. Una modificación notable implica la incorporación de pequeñas cantidades, aproximadamente el 0,0035 %, de dodecil sulfato de sodio (SDS). Se ha demostrado que esta inclusión de SDS da como resultado un aumento de cuatro veces en la respuesta de color para tres proteínas de colágeno clave (colágenos de tipo I, III y IV), al tiempo que disminuye simultáneamente la absorbancia de las proteínas no colágenas. [19]
Esta simple modificación en la preparación del reactivo dio como resultado que los ensayos de Bradford produjeran curvas de respuesta similares tanto para proteínas de colágeno como para proteínas no colágenas, ampliando el uso de los ensayos de Bradford en muestras que contienen un alto contenido de proteínas de colágeno.
En resumen, para encontrar una curva estándar, se deben utilizar concentraciones variables de BSA ( albúmina de suero bovino ) [2] para crear una curva estándar con la concentración graficada en el eje x y la absorbancia graficada en el eje y. Solo se utiliza una concentración estrecha de BSA (2-10 ug/mL) para crear una curva estándar precisa. [23] El uso de un rango amplio de concentración de proteína hará que sea más difícil determinar la concentración de la proteína desconocida. Esta curva estándar se utiliza luego para determinar la concentración de la proteína desconocida. A continuación, se explica en detalle cómo se pasa de la curva estándar a la concentración de la proteína desconocida.
En primer lugar, agregue una línea de mejor ajuste, o regresión lineal , y muestre la ecuación en el gráfico. Lo ideal es que el valor R 2 sea lo más cercano posible a 1. R representa la suma de los valores cuadrados del ajuste restados de cada punto de datos. Por lo tanto, si R 2 es mucho menor que uno, considere repetir el experimento para obtener uno con datos más confiables. [24]
La ecuación que se muestra en el gráfico proporciona un medio para calcular la absorbancia y, por lo tanto, la concentración de las muestras desconocidas. En el gráfico 1, x es la concentración e y es la absorbancia, por lo que se debe reorganizar la ecuación para resolver x e ingresar la absorbancia de la muestra desconocida medida. [25] Es probable que la muestra desconocida tenga números de absorbancia fuera del rango del estándar. Estos no deben incluirse en los cálculos, ya que la ecuación dada no puede aplicarse a números fuera de sus limitaciones. A gran escala, se debe calcular el coeficiente de extinción utilizando la Ley de Beer-Lambert A=εLC en la que A es la absorbancia medida, ε es la pendiente de la curva estándar, L es la longitud de la cubeta y C es la concentración que se está determinando. [26] A microescala, no se puede utilizar una cubeta y, por lo tanto, solo se debe reorganizar para resolver x.
Para lograr una concentración que tenga sentido con los datos, las diluciones, concentraciones y unidades de la proteína desconocida deben normalizarse (Tabla 1). Para ello, se debe dividir la concentración por el volumen de proteína para normalizar la concentración y multiplicar por la cantidad diluida para corregir cualquier dilución realizada en la proteína antes de realizar el ensayo.
Los ensayos de proteínas alternativos incluyen:
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