El análisis de flujo metabólico (MFA) es una técnica fluxómica experimental que se utiliza para examinar las tasas de producción y consumo de metabolitos en un sistema biológico. A nivel intracelular, permite la cuantificación de los flujos metabólicos , lo que permite dilucidar el metabolismo central de la célula. [1] Varios métodos de MFA, incluido el análisis de flujo metabólico isotópicamente estacionario, el análisis de flujo metabólico isotópicamente no estacionario y el análisis de flujo metabólico basado en la termodinámica, se pueden combinar con modelos estequiométricos de metabolismo y métodos de espectrometría de masas con resolución de masa isotópica para dilucidar la transferencia de fracciones que contienen trazadores isotópicos de un metabolito a otro y derivar información sobre la red metabólica. El análisis de flujo metabólico (MFA) tiene muchas aplicaciones, como determinar los límites de la capacidad de un sistema biológico para producir un bioquímico como el etanol , [2] predecir la respuesta a la inactivación de genes , [3] [4] y guiar la identificación de enzimas de cuello de botella en redes metabólicas para esfuerzos de ingeniería metabólica . [5]
El análisis de flujo metabólico puede utilizar trazadores de isótopos marcados con 13 C para experimentos de marcado isotópico . Las técnicas de resonancia magnética nuclear ( RMN ) y la espectrometría de masas se pueden utilizar para medir los patrones de marcado de metabolitos para proporcionar información para la determinación de los flujos de las vías. [6] [1] [7] Debido a que el MFA generalmente requiere un cálculo riguroso del flujo de redes metabólicas complejas, se han desarrollado herramientas de software disponibles públicamente para automatizar el MFA y reducir su carga computacional.
Aunque el uso de un equilibrio estequiométrico y de restricciones de los metabolitos que componen la red metabólica puede dilucidar los flujos, este enfoque tiene limitaciones, incluida la dificultad de estimular los flujos a través de vías paralelas, cíclicas y reversibles. [8] Además, existe un conocimiento limitado sobre cómo los metabolitos se interconvierten en una red metabólica sin el uso de trazadores isotópicos. [8] Por lo tanto, el uso de isótopos se ha convertido en la técnica dominante para la MFA. [9]
Los experimentos de etiquetado de isótopos son óptimos para recopilar datos experimentales necesarios para la MFA. Debido a que los flujos determinan los patrones de etiquetado isotópico de los metabolitos intracelulares, la medición de estos patrones permite la inferencia de flujos. [10] El primer paso en el flujo de trabajo de los experimentos de etiquetado de isótopos es el cultivo celular en sustratos etiquetados. Un sustrato como la glucosa se etiqueta con isótopos, con mayor frecuencia 13 C, y se introduce en el medio de cultivo. El medio también contiene típicamente vitaminas y aminoácidos esenciales para facilitar el crecimiento de las células. [11] El sustrato etiquetado es luego metabolizado por las células, lo que lleva a la incorporación del trazador 13 C en otros metabolitos intracelulares. Después de que las células alcanzan la fisiología de estado estable (es decir, concentraciones constantes de metabolitos en el cultivo), las células se lisan para extraer metabolitos. Para las células de mamíferos, la extracción implica la extinción de las células utilizando metanol para detener su metabolismo celular y la posterior extracción de metabolitos utilizando metanol y extracción con agua. [12] Las concentraciones de metabolitos e isótopos marcados en los metabolitos de los extractos se miden mediante instrumentos como cromatografía líquida-espectrometría de masas o RMN, que también proporcionan información sobre la posición y el número de átomos marcados en los metabolitos. [11] Estos datos son necesarios para comprender la dinámica del metabolismo intracelular y las tasas de recambio de metabolitos para inferir el flujo metabólico.
Un método predominante para el análisis de flujo metabólico es el MFA isotópicamente estacionario. Esta técnica para la cuantificación de flujo es aplicable en estado estacionario metabólico e isotópico, [13] dos condiciones que suponen que las concentraciones de metabolitos y las distribuciones de isotopómeros no cambian con el tiempo, respectivamente. El conocimiento de la matriz estequiométrica (S) que comprende el consumo y la producción de metabolitos dentro de las reacciones bioquímicas es necesario para equilibrar los flujos (v) en torno al modelo de red metabólica asumido. [13] Suponiendo un estado estacionario metabólico, los flujos metabólicos pueden cuantificarse resolviendo la inversa de la siguiente ecuación de álgebra lineal simple :
Para reducir el posible espacio de solución para las distribuciones de flujo, el MFA isotópicamente estacionario requiere restricciones estequiométricas adicionales, como tasas de crecimiento, secreción y absorción de sustrato y tasas de acumulación de producto, así como límites superiores e inferiores para los flujos. [14] Aunque el MFA isotópicamente estacionario permite una deducción precisa de los flujos metabólicos a través de modelos matemáticos, el análisis se limita a cultivos por lotes durante la fase exponencial. [15] Además, después de la adición de un sustrato marcado, el punto temporal en el que se puede suponer con precisión el estado estacionario metabólico e isotópico puede ser difícil de determinar. [13]
Cuando el etiquetado isotópico es transitorio y aún no se ha equilibrado, el MFA isotópicamente no estacionario (INST-MFA) es ventajoso para deducir flujos, particularmente para sistemas con dinámicas de etiquetado lentas. De manera similar al MFA isotópicamente estacionario, este método requiere balances de masa e isotopómeros para caracterizar la estequiometría y las transiciones atómicas de la red metabólica. Sin embargo, a diferencia de los métodos MFA tradicionales, el INST-MFA requiere la aplicación de ecuaciones diferenciales ordinarias para examinar cómo cambian los patrones de etiquetado isotópico de los metabolitos con el tiempo; dicho examen se puede lograr midiendo los patrones de etiquetado isotópico cambiantes en diferentes puntos de tiempo para ingresarlos en el INST-MFA. [16] Por lo tanto, el INST-MFA es un método poderoso para dilucidar los flujos de sistemas con cuellos de botella en las vías y revelar fenotipos metabólicos de organismos autótrofos . [16] Aunque las demandas computacionales intensivas de INST-MFA anteriormente obstaculizaban su uso generalizado, las herramientas de software desarrolladas recientemente han simplificado INST-MFA para disminuir el tiempo computacional y la demanda. [17]
El análisis de flujo metabólico basado en la termodinámica (TMFA) [18] es un tipo especializado de análisis de flujo metabólico que utiliza restricciones termodinámicas lineales además de restricciones de balance de masa para generar flujos termodinámicamente factibles y perfiles de actividad de metabolitos. El TMFA solo tiene en cuenta las vías y los flujos que son factibles mediante el uso del cambio de energía libre de Gibbs de las reacciones y actividades de los metabolitos que forman parte del modelo. Al calcular las energías libres de Gibbs de las reacciones metabólicas y, en consecuencia, su favorabilidad termodinámica, el TMFA facilita la identificación de reacciones limitantes de cuello de botella de la vía que pueden ser candidatas ideales para la regulación de la vía.
Se necesitan algoritmos de simulación para modelar el sistema biológico y calcular los flujos de todas las vías en una red compleja. Existen varios programas informáticos para satisfacer la necesidad de herramientas eficientes y precisas para la cuantificación de flujos. En general, los pasos para aplicar software de modelado para MFA incluyen la reconstrucción metabólica para compilar todas las reacciones enzimáticas y metabolitos deseados, proporcionar información experimental como el patrón de etiquetado del sustrato, definir restricciones como ecuaciones de crecimiento y minimizar el error entre los resultados experimentales y simulados para obtener flujos finales. [19] Los ejemplos de software MFA incluyen 13CFLUX2 [20] y OpenFLUX, [21] que evalúan experimentos de etiquetado de 13 C para el cálculo de flujo en condiciones metabólicas e isotópicamente estacionarias. El creciente interés en el desarrollo de herramientas de cálculo para el cálculo INST-MFA también ha llevado al desarrollo de aplicaciones de software como INCA, que fue el primer software capaz de realizar INST-MFA y simular experimentos de etiquetado de isótopos transitorios. [22]
El análisis de flujo metabólico se ha utilizado para guiar los esfuerzos de ampliación de escala para la fermentación de biocombustibles. [23] Al medir directamente las tasas de reacción enzimática, el MFA puede capturar la dinámica del comportamiento de las células y los fenotipos metabólicos en biorreactores durante fermentaciones a gran escala. [23] Por ejemplo, los modelos MFA se utilizaron para optimizar la conversión de xilosa en etanol en levaduras fermentadoras de xilosa mediante el uso de distribuciones de flujo calculadas para determinar las capacidades teóricas máximas de la levadura seleccionada para la producción de etanol. [24]
La identificación de enzimas que actúan como cuello de botella determina las reacciones que limitan la velocidad y que limitan la productividad de una vía biosintética. Además, el análisis de enzimas múltiples puede ayudar a predecir fenotipos inesperados de cepas modificadas genéticamente al generar una comprensión fundamental de cómo se conectan los flujos en las células modificadas. [25] Por ejemplo, al calcular las energías libres de Gibbs de las reacciones en el metabolismo de Escherichia coli , el análisis de enzimas múltiples facilitó la identificación de una reacción termodinámica que actúa como cuello de botella en un modelo a escala del genoma de Escherichia coli. [18]
