La ingeniería metabólica es la práctica de optimizar los procesos genéticos y reguladores dentro de las células para aumentar la producción celular de una determinada sustancia. Estos procesos son redes químicas que utilizan una serie de reacciones bioquímicas y enzimas que permiten a las células convertir las materias primas en moléculas necesarias para la supervivencia de la célula. La ingeniería metabólica busca específicamente modelar matemáticamente estas redes, calcular un rendimiento de productos útiles y señalar las partes de la red que limitan la producción de estos productos. [1] Las técnicas de ingeniería genética se pueden utilizar para modificar la red con el fin de aliviar estas limitaciones. Una vez más, esta red modificada se puede modelar para calcular el rendimiento del nuevo producto.
El objetivo final de la ingeniería metabólica es poder utilizar estos organismos para producir sustancias valiosas a escala industrial de una manera rentable. Los ejemplos actuales incluyen la producción de cerveza , vino , queso , productos farmacéuticos y otros productos biotecnológicos . [2] Otra posible área de uso es el desarrollo de cultivos oleaginosos cuya composición se ha modificado para mejorar su valor nutricional. [3] Algunas de las estrategias comunes utilizadas para la ingeniería metabólica son (1) sobreexpresar el gen que codifica la enzima limitante de la velocidad de la vía biosintética, (2) bloquear las vías metabólicas competitivas, (3) expresión génica heteróloga y (4) ingeniería enzimática. [4]
Dado que las células utilizan estas redes metabólicas para su supervivencia, los cambios pueden tener efectos drásticos en la viabilidad de las células. Por lo tanto, en la ingeniería metabólica surgen compensaciones entre la capacidad de las células para producir la sustancia deseada y sus necesidades naturales de supervivencia. Por lo tanto, en lugar de eliminar y/o sobreexpresar directamente los genes que codifican las enzimas metabólicas, el enfoque actual es apuntar a las redes reguladoras en una célula para diseñar eficientemente el metabolismo. [5]
En el pasado, para aumentar la productividad de un metabolito deseado , se modificaba genéticamente un microorganismo mediante una mutación inducida químicamente y luego se elegía la cepa mutante que sobreexpresaba el metabolito deseado. [6] Sin embargo, uno de los principales problemas con esta técnica era que no se analizaba la vía metabólica para la producción de ese metabolito y, como resultado, se desconocían las limitaciones a la producción y las enzimas de la vía relevante que se debían modificar. [6]
En la década de 1990, surgió una nueva técnica llamada ingeniería metabólica. Esta técnica analiza la ruta metabólica de un microorganismo y determina las restricciones y sus efectos en la producción de compuestos deseados. Luego utiliza la ingeniería genética para aliviar estas restricciones. Algunos ejemplos de ingeniería metabólica exitosa son los siguientes: (i) Identificación de restricciones a la producción de lisina en Corynebacterium glutamicum e inserción de nuevos genes para aliviar estas restricciones para mejorar la producción [7] (ii) Ingeniería de una nueva ruta de biosíntesis de ácidos grasos , llamada ruta de oxidación beta inversa , que es más eficiente que la ruta nativa en la producción de ácidos grasos y alcoholes que potencialmente pueden convertirse catalíticamente en productos químicos y combustibles [8] (iii) Producción mejorada de DAHP, un metabolito aromático producido por E. coli que es un intermediario en la producción de aminoácidos aromáticos. [9] Se determinó a través del análisis de flujo metabólico que el rendimiento máximo teórico de DAHP por molécula de glucosa utilizada, fue de 3/7. Esto se debe a que parte del carbono de la glucosa se pierde en forma de dióxido de carbono, en lugar de utilizarse para producir DAHP. Además, uno de los metabolitos (PEP o fosfoenolpiruvato ) que se utilizan para producir DAHP, se estaba convirtiendo en piruvato (PYR) para transportar glucosa a la célula y, por lo tanto, ya no estaba disponible para producir DAHP. Para aliviar la escasez de PEP y aumentar el rendimiento, Patnaik et al. utilizaron ingeniería genética en E. coli para introducir una reacción que convierte PYR nuevamente en PEP. De este modo, el PEP utilizado para transportar glucosa a la célula se regenera y puede utilizarse para producir DAHP. Esto dio como resultado un nuevo rendimiento máximo teórico de 6/7, el doble del sistema nativo de E. coli .
A escala industrial, la ingeniería metabólica se está volviendo más conveniente y rentable. Según la Organización de la Industria Biotecnológica , " se están construyendo más de 50 instalaciones de biorrefinería en toda América del Norte para aplicar la ingeniería metabólica para producir biocombustibles y productos químicos a partir de biomasa renovable que pueden ayudar a reducir las emisiones de gases de efecto invernadero". Los biocombustibles potenciales incluyen alcoholes y alcanos de cadena corta (para reemplazar la gasolina ), ésteres metílicos de ácidos grasos y alcoholes grasos (para reemplazar el diésel ) y biocombustibles basados en ácidos grasos e isoprenoides (para reemplazar el diésel ). [10]
La ingeniería metabólica continúa evolucionando en eficiencia y procesos con la ayuda de los avances en el campo de la biología sintética y el progreso en la comprensión del daño de los metabolitos y su reparación o prevención . Los primeros experimentos de ingeniería metabólica mostraron que la acumulación de intermediarios reactivos puede limitar el flujo en las vías diseñadas y ser perjudicial para las células huésped si faltan sistemas de control de daños o estos son inadecuados. [11] [12] Los investigadores en biología sintética optimizan las vías genéticas, que a su vez influyen en los resultados metabólicos celulares. Las recientes disminuciones en el costo del ADN sintetizado y los avances en los circuitos genéticos ayudan a influir en la capacidad de la ingeniería metabólica para producir los resultados deseados. [13]
Se puede encontrar un análisis del flujo metabólico en Análisis del balance de flujo
El primer paso del proceso es identificar un objetivo deseado que se desea alcanzar mediante la mejora o modificación del metabolismo de un organismo. Se utilizan libros de referencia y bases de datos en línea para investigar las reacciones y las vías metabólicas que pueden producir este producto o resultado. Estas bases de datos contienen abundante información genómica y química, incluidas las vías para el metabolismo y otros procesos celulares. Mediante esta investigación, se elige un organismo que se utilizará para crear el producto o resultado deseado. Las consideraciones que se tienen en cuenta al tomar esta decisión son qué tan cerca está la vía metabólica del organismo de la vía deseada, los costos de mantenimiento asociados con el organismo y qué tan fácil es modificar la vía del organismo. Escherichia coli ( E. coli ) se usa ampliamente en ingeniería metabólica para sintetizar una amplia variedad de productos como aminoácidos porque es relativamente fácil de mantener y modificar. [14] Si el organismo no contiene la vía completa para el producto o resultado deseado, entonces se deben incorporar al organismo los genes que producen las enzimas faltantes.
La ruta metabólica completa se modela matemáticamente para encontrar el rendimiento teórico del producto o los flujos de reacción en la célula. Un flujo es la velocidad a la que ocurre una reacción dada en la red. El análisis simple de la ruta metabólica se puede hacer a mano, pero la mayoría requiere el uso de software para realizar los cálculos. [15] Estos programas utilizan algoritmos complejos de álgebra lineal para resolver estos modelos. Para resolver una red utilizando la ecuación para sistemas determinados que se muestra a continuación, se debe ingresar la información necesaria sobre las reacciones relevantes y sus flujos. La información sobre la reacción (como los reactivos y la estequiometría) está contenida en las matrices G x y G m . Las matrices V m y V x contienen los flujos de las reacciones relevantes. Cuando se resuelve, la ecuación produce los valores de todos los flujos desconocidos (contenidos en V x ).
Después de resolver los flujos de reacciones en la red, es necesario determinar qué reacciones se pueden alterar para maximizar el rendimiento del producto deseado. Para determinar qué manipulaciones genéticas específicas se deben realizar, es necesario utilizar algoritmos computacionales, como OptGene u OptFlux. [16] Proporcionan recomendaciones sobre qué genes se deben sobreexpresar, eliminar o introducir en una célula para permitir una mayor producción del producto deseado. Por ejemplo, si una reacción dada tiene un flujo particularmente bajo y está limitando la cantidad de producto, el software puede recomendar que la enzima que cataliza esta reacción se sobreexprese en la célula para aumentar el flujo de reacción. Las manipulaciones genéticas necesarias se pueden realizar utilizando técnicas estándar de biología molecular. Los genes se pueden sobreexpresar o eliminar de un organismo, dependiendo de su efecto sobre la vía y el objetivo final. [17]
Para crear un modelo solucionable, a menudo es necesario tener ciertos flujos ya conocidos o medidos experimentalmente. Además, para verificar el efecto de las manipulaciones genéticas en la red metabólica (para garantizar que se alineen con el modelo), es necesario medir experimentalmente los flujos en la red. Para medir los flujos de reacción, se realizan mediciones de flujo de carbono utilizando el etiquetado isotópico de carbono-13 . [18] El organismo se alimenta con una mezcla que contiene moléculas donde los carbonos específicos están diseñados para ser átomos de carbono-13, en lugar de carbono-12. Después de que estas moléculas se utilizan en la red, los metabolitos posteriores también se etiquetan con carbono-13, ya que incorporan esos átomos en sus estructuras. El patrón de etiquetado específico de los diversos metabolitos está determinado por los flujos de reacción en la red. Los patrones de etiquetado se pueden medir utilizando técnicas como la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) junto con algoritmos computacionales para determinar los flujos de reacción.
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