Las dendrotoxinas son una clase de neurotoxinas presinápticas producidas por serpientes mamba ( Dendroaspis ) que bloquean subtipos particulares de canales de potasio dependientes de voltaje en las neuronas , mejorando así la liberación de acetilcolina en las uniones neuromusculares . Debido a su alta potencia y selectividad por los canales de potasio, las dendrotoxinas han demostrado ser extremadamente útiles como herramientas farmacológicas para estudiar la estructura y función de estas proteínas de canales iónicos .
Se ha demostrado que las dendrotoxinas bloquean subtipos particulares de canales de potasio (K + ) dependientes de voltaje en el tejido neuronal. [ cita necesaria ] En el sistema nervioso, los canales de K + dependientes de voltaje controlan la excitabilidad de los nervios y músculos al controlar el potencial de membrana en reposo y al repolarizar la membrana durante los potenciales de acción . Se ha demostrado que la dendrotoxina se une a los nódulos de Ranvier de las neuronas motoras [1] y bloquea la actividad de estos canales de potasio. De esta manera, las dendrotoxinas prolongan la duración de los potenciales de acción y aumentan la liberación de acetilcolina en la unión neuromuscular, lo que puede provocar hiperexcitabilidad muscular y síntomas convulsivos.
Las dendrotoxinas son proteínas de ~7 kDa que constan de una única cadena peptídica de aproximadamente 57 a 60 aminoácidos . Se han aislado varios homólogos de alfa-dendrotoxina, y todos poseen una secuencia ligeramente diferente. Sin embargo, la arquitectura molecular y la conformación de plegado de estas proteínas son todas muy similares. Las dendrotoxinas poseen una hélice 3 10 muy corta cerca del extremo N del péptido, mientras que una hélice alfa de dos vueltas se encuentra cerca del extremo C. Una lámina β antiparalela de dos cadenas ocupa la parte central de la estructura molecular. Estas dos cadenas β están conectadas por una región de giro β distorsionada [2] que se cree que es importante para la actividad de unión de la proteína. Todas las dendrotoxinas están entrecruzadas por tres puentes disulfuro , que añaden estabilidad a la proteína y contribuyen en gran medida a su conformación estructural. Los residuos de cisteína que forman estos enlaces disulfuro se han conservado entre todos los miembros de la familia de las dendrotoxinas y están ubicados en C7-C57, C16-C40 y C32-C53 (numeración según la alfa-dendrotoxina).
Las dendrotoxinas son estructuralmente homólogas a los inhibidores de serina proteasa de tipo Kunitz , incluido el inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI). Se ha demostrado que la alfa-dendrotoxina y BPTI tienen una identidad de secuencia del 35%, así como enlaces disulfuro idénticos. A pesar de la homología estructural entre estas dos proteínas, las dendrotoxinas no parecen exhibir ninguna actividad proteasa inhibidora mensurable como la BPTI. Esta pérdida de actividad parece ser el resultado de la ausencia de residuos de aminoácidos clave que producen diferencias estructurales que dificultan las interacciones clave necesarias para la actividad de la proteasa observada en BPTI.
Las dendrotoxinas son proteínas básicas que poseen una carga neta positiva cuando están presentes en un pH neutro . La mayoría de los residuos de aminoácidos cargados positivamente de las dendrotoxinas se encuentran en la parte inferior de la estructura, creando un dominio catiónico en un lado de la proteína. La carga positiva resulta de los residuos de lisina (Lys) y arginina (Arg) que se concentran en tres regiones primarias de la proteína: cerca del extremo N (Arg3, Arg4, Lys5), cerca del extremo C (Arg54, Arg55) y en la estrecha región de giro β (Lys28, Lys29, Lys30). [3] Se cree que estos residuos cargados positivamente pueden desempeñar un papel crítico en la actividad de unión de dendrotoxinas, ya que pueden realizar interacciones potenciales con los sitios aniónicos (aminoácidos cargados negativamente) en los poros de los canales de potasio.
Una sola molécula de dendrotoxina se asocia reversiblemente con un canal de potasio para ejercer su efecto inhibidor. Se propone que esta interacción esté mediada por interacciones electrostáticas entre los residuos de aminoácidos cargados positivamente en el dominio catiónico de la dendrotoxina y los residuos cargados negativamente en el poro del canal iónico . Se cree que los canales de potasio, al igual que otros canales selectivos de cationes, tienen una nube de cargas negativas que preceden a la apertura del poro del canal y que ayudan a conducir los iones de potasio a través de la vía de permeación. Generalmente se cree (aunque no se ha demostrado) que las moléculas de dendrotoxina se unen a sitios aniónicos cerca de la superficie extracelular del canal y ocluyen físicamente el poro, impidiendo así la conductancia iónica. Sin embargo, Imredy y MacKinnon [4] han propuesto que la delta-dendrotoxina puede tener un sitio de unión descentrado en sus proteínas objetivo y puede inhibir el canal alterando la estructura del canal, en lugar de bloquear físicamente el poro.
Muchos estudios han intentado identificar qué residuos de aminoácidos son importantes para la actividad de unión de las dendrotoxinas a sus objetivos del canal de potasio. Harvey y cols. [5] utilizaron modificaciones específicas de residuos para identificar residuos cargados positivamente que eran cruciales para la actividad bloqueadora de la dendrotoxina-I. Informaron que la acetilación de Lys5 cerca de la región N-terminal y Lys29 en la región de giro beta condujo a disminuciones sustanciales en la afinidad de unión de DTX-I. Se han mostrado resultados similares con la dendrotoxina-K utilizando mutagénesis dirigida para sustituir residuos de lisina y arginina cargados positivamente por alaninas neutras . Estos resultados, junto con muchos otros, han implicado que las lisinas cargadas positivamente en la mitad N-terminal, particularmente Lys5 en la hélice 3 10 , desempeñan un papel muy importante en la unión de las dendrotoxinas a sus objetivos del canal de potasio. Los residuos de lisina en la región del giro β han proporcionado resultados más confusos, pareciendo ser biológicamente críticos en algunos homólogos de dendrotoxina y no necesarios para otros. Además, la mutación de todo el triplete de lisina (K28-K29-K30) a Ala-Ala-Gly en alfa-DTX produjo muy pocos cambios en la actividad biológica.
Existe un acuerdo general de que el residuo de lisina conservado cerca del extremo N (Lys5 en alfa-DTX) es crucial para la actividad biológica de todas las dendrotoxinas, mientras que residuos adicionales, como los de la región del giro beta, podrían desempeñar un papel. en la especificidad de las dendrotoxinas al mediar las interacciones de toxinas individuales con sus sitios objetivo individuales. Esto no sólo ayuda a explicar la estricta especificidad de algunas dendrotoxinas para diferentes subtipos de canales de K + dependientes de voltaje , sino que también explica las diferencias en la potencia de las dendrotoxinas para los canales de K + comunes . Por ejemplo, Wang et al. [6] demostró que la interacción de la dendrotoxina-K con K V 1.1 está mediada por sus residuos de lisina tanto en el extremo N como en la región de giro β, mientras que la alfa-dendrotoxina parece interactuar con su objetivo únicamente a través del extremo N. . Este dominio interactivo menos expansivo puede ayudar a explicar por qué la alfa-dendrotoxina es menos discriminativa mientras que la dendrotoxina-K es estrictamente selectiva para K V 1.1.
Los canales de potasio de las neuronas de los vertebrados muestran un alto grado de diversidad que permite a las neuronas ajustar con precisión sus propiedades de señalización eléctrica mediante la expresión de diferentes combinaciones de subunidades de los canales de potasio. Además, debido a que regulan el flujo iónico a través de las membranas biológicas, son importantes en muchos aspectos de la regulación celular y la transducción de señales de diferentes tipos de células. Por lo tanto, los canales de potasio dependientes de voltaje son objetivos para una amplia gama de potentes toxinas biológicas de organismos como serpientes, escorpiones , anémonas de mar y caracoles cono . Así, la purificación del veneno ha permitido aislar toxinas peptídicas como las dendrotoxinas, que se han convertido en herramientas farmacológicas útiles para el estudio de los canales de potasio. Debido a su potencia y selectividad por diferentes subtipos de canales de potasio, las dendrotoxinas se han vuelto útiles como sondas moleculares para el estudio estructural y funcional de estas proteínas. Esto puede ayudar a mejorar nuestra comprensión de las funciones que desempeñan los tipos de canales individuales, así como ayudar en la clasificación farmacológica de estos diversos tipos de canales. [7] Además, la disponibilidad de dendrotoxinas radiomarcadas proporciona una herramienta para la detección de otras fuentes en la búsqueda de nuevas toxinas de los canales de potasio, como la clase kalicludina de toxinas de los canales de potasio en las anémonas de mar. Por último, la información estructural proporcionada por las dendrotoxinas puede proporcionar pistas para la síntesis de compuestos terapéuticos que pueden apuntar a clases particulares de canales de potasio. La dendrotoxina I también se ha utilizado para ayudar a purificar y caracterizar la proteína del canal K+ a la que se une mediante diferentes técnicas de cromatografía y ensayos de unión. [8]