El virus Y de la papa (PVY) es un virus fitopatógeno de la familia Potyviridae y uno de los virus vegetales más importantes que afectan a la producción de papa .
La infección de las plantas de patata por PVY produce una variedad de síntomas según la cepa viral . El más leve de estos síntomas es la pérdida de producción, pero el más perjudicial es la "enfermedad de la mancha anular necrótica del tubérculo de la patata" (PTNRD). Las manchas anulares necróticas hacen que las patatas no se puedan comercializar y, por lo tanto, pueden dar lugar a una pérdida significativa de ingresos. El PVY es transmisible por los pulgones vectores, pero también puede permanecer latente en las patatas de semilla. Esto significa que el uso de la misma línea de patata para la producción de patatas de semilla durante varias generaciones consecutivas conducirá a un aumento progresivo de la carga viral y la consiguiente pérdida de la cosecha .
En los últimos años, el aumento de las infecciones virales en las plantas de patata ha provocado pérdidas considerables en la industria sudafricana de la patata. El aumento de la tasa de infección puede atribuirse a varios factores, entre ellos, una marcada disminución de la eficacia y la administración de los productos químicos utilizados para el control de vectores, el uso de patatas de siembra infectadas en el cultivo, métodos de riego y cultivo incorrectos, así como la falta de un método de detección sensible, rápido y fiable. [1] Un aumento de la temperatura media de los inviernos como consecuencia del calentamiento global también ha provocado un aumento de la cantidad de pulgones, lo que a su vez ha provocado un aumento de la distribución viral. [1] [ cita requerida ]
PVY pertenece al género Potyvirus , el género más grande de virus de plantas y posiblemente el más destructivo en los cultivos de papa. [2] El género incluye más de 200 especies que provocan pérdidas significativas en el ámbito agrícola. [3] PVY infecta muchas especies de plantas económicamente importantes. Estas incluyen la papa ( Solanum tuberosum ), el tabaco ( Nicotiana tabacum ), el tomate ( Solanum lycopersicum ) y el pimiento ( Capsicum spp.). [4] El nivel de daño al cultivo está determinado por la cepa de PVY que infecta las plantas, la carga viral, el momento en que ocurre la infección, así como la tolerancia que posee el huésped hacia el virus. [5] La resistencia a la infección por PVY por parte de los huéspedes es baja en muchos casos. La infección de un campo de papa con PVY puede, en última instancia, resultar en una pérdida del 10 al 100% en el rendimiento. [5]
Se ha demostrado que el PVY tiene diferentes aislados según los síntomas que inducen en varias especies de plantas de papa. [6] La amplia variabilidad biológica, serológica y molecular de los aislados de PVY hace que la clasificación de los aislados como cepas particulares sea particularmente difícil. La aparición de una variedad de síntomas y la aparición del NTN necrótico de PVY ha llevado a la búsqueda de herramientas de clasificación más confiables que la simple identificación serológica. Tradicionalmente se reconocen tres cepas principales de PVY: PVY C , PVY N y PVY O. PVY C , originalmente conocido como Virus de la Papa C , fue el primero en ser reconocido y se identificó en la década de 1930. [7] PVY C induce respuestas hipersensibles en una amplia gama de cultivares de papa. Estas reacciones incluyen la formación de patrones de mosaico suave o vetas punteadas. A diferencia de las otras cepas de PVY, algunas cepas de PVY C no son transmisibles por pulgones. [8] Estudios previos de Visser et al. [9] no identificaron ninguno de los aislados locales como PVY C pero se ha informado de su presencia en patatas en Sudáfrica. [10] [11] Una segunda cepa de PVY es PVY N. [ 12] Esta cepa se describió en plantas de tabaco que crecen cerca de plantas de patata. [13] PVY N produce necrosis foliar y daños leves o incluso nulos en los tubérculos. La cepa ordinaria de PVY se denomina PVY O. La infección de una planta de patata con la cepa PVY O produce daños leves en los tubérculos y no causa necrosis foliar. [14] Tanto PVY N como PVY O son transmisibles por pulgones y se encuentran en Sudáfrica. En Europa, se ha demostrado que estas dos cepas se han recombinado para formar PVY NTN . [15] [16] Se ha acreditado que el PVY NTN tiene la capacidad de inducir la enfermedad de la mancha anular necrótica del tubérculo de la patata (PTNRD). [15] Los tubérculos dañados por PTNRD se vuelven no comercializables y la infección por PVY NTN resulta en un impacto económico mayor que la infección por las otras cepas.
El PVY puede transmitirse a las plantas de papa a través de injertos , inoculación de savia de la planta y a través de la transmisión de pulgones . La forma más común de infección por PVY del material vegetal en el campo es a través del pulgón, y aunque los pulgones por sí solos pueden dañar directamente las plantas de papa, es su papel como vectores virales el que tiene el mayor impacto económico. [17] [18] [19] En climas fríos, los pulgones pasan el invierno como pulgones sin alas dando a luz a crías vivas (vivíparos) o como huevos. Los huéspedes como las malezas y otros cultivos sirven como lugares de reproducción para estos pulgones y forman un área temporal de colonización antes de que los pulgones migren a los campos de papa. [18] En climas moderados, como en Sudáfrica, se cree que los pulgones se reproducen asexualmente en las malezas, otros cultivos, plantas autóctonas y plantas de jardín. Esto significa que hay una cantidad de pulgones presentes durante todo el año. En una revisión de Radcliffe y Ragsdale (2002) se destaca la importancia de un monitoreo efectivo y estricto de las poblaciones de pulgones, ya que los viriones de PVY se introducen en los campos de papa casi exclusivamente a través de pulgones alados provenientes de una fuente de virus fuera de estos campos. Los pulgones sin alas aún no se han vinculado con la propagación de PVY en los campos de papa. [20]
Se ha descubierto que el pulgón verde del duraznero ( Myzus persicae ) es el más eficaz en su papel como vector viral, [5] [17] [21] pero otros como Aphis fabae , Aphis gossypii , Aphis nasturtii , Macrosiphum euphorbiae , Myzus (Nectarosiphon) certus , Myzus (Phorodon) humuli y Rhopalosiphum insertum también están fuertemente asociados con la transmisión viral. [17] [21] El Agricultural Research Council-Vegetable and Ornamental Plant Institute (ARC-VOPI) 6 de Sudáfrica identificó veinticinco especies de pulgones capaces de funcionar como vectores de PVY. [22] También se establecieron las eficiencias de algunos de estos pulgones para funcionar como vectores de PVY (Ragsdale et al., 2001) y se encontró que variaban entre las diferentes especies. En Sudáfrica, Aphis fabae , Aphis gossypii y Aphis nasturtii son los vectores de PVY más comunes y eficientes que se encuentran en el campo. [5] Además de clasificarse según la eficiencia como vectores, los pulgones también se pueden dividir en dos subgrupos, a saber, especies colonizadoras y no colonizadoras. Los pulgones colonizadores son pulgones que se reproducen y se establecen en plantas de papa, específicamente, mientras que los pulgones no colonizadores no se reproducen ni establecen colonias en plantas de papa. Los pulgones colonizadores están mejor adaptados a la vida en plantas de papa y, por lo tanto, generalmente se consideran mejores vectores de PVY que los pulgones no colonizadores. Los pulgones no colonizadores no se alimentan principalmente de plantas de papa, pero ocasionalmente se alimentan de ellas mientras buscan un huésped más adecuado. Su menor eficiencia como vector de PVY se cancela por la gran cantidad en la que ocurren. [19] [23] Debido a esto, todos los pulgones presentes en los campos de papa y sus alrededores deben considerarse como posibles vectores y sus números deben monitorearse cuidadosamente.
La transmisión del PVY por los pulgones se produce de forma no persistente y no circulativa, lo que sugiere una interacción menos íntima entre el virión y el vector que en el caso de los viriones circulantes. [24] El hecho de que los viriones se transmitan de forma no persistente significa que la replicación viral no se produce dentro del pulgón vector y que, a menos que el pulgón se alimente de plantas infectadas, pierde su capacidad de infectar plantas después de dos o tres alimentaciones. [5] [25] Los viriones se adhieren al estilete del pulgón en cuestión de segundos y pueden seguir siendo infecciosos durante cuatro a diecisiete horas. [26] [27] La distancia a la que se pueden transmitir los viriones es limitada debido al corto período durante el cual siguen siendo infecciosos. [23] Aunque la corta vida fuera de las plantas inhibe la transmisión viral a larga distancia, no reduce la eficiencia de transmisión otorgada por la rápida tasa de adquisición e inoculación viral dentro de un campo.
Al entrar en la célula vegetal, la proteína de la cubierta del virus se desmonta y libera su genoma de ARN . El ARN viral sirve como ARNm y, aunque se sabe poco sobre su traducción, se cree que la región no codificante 5' funciona como un potenciador de la traducción. [28] El ARNm traducido da como resultado una poliproteína que se procesa en proteínas maduras. Luego, cada poliproteína se divide en diez proteínas diferentes que se cree que son multifuncionales. Estas proteínas, junto con las proteínas del huésped, se ensamblan para formar un complejo de replicación. Este complejo realiza la síntesis de ARN de cadena negativa , utilizando la cadena positiva del ARN viral como plantilla. Una vez que se han producido las copias de ARN adicionales, codifican la síntesis de varias proteínas, como se mencionó anteriormente, así como las proteínas de la cubierta. Estas proteínas de la cubierta ahora encerrarán los genomas recién formados para dar lugar a nuevos viriones . Se ha sugerido que el encierro de los viriones recién formados se inicia por la interacción de las proteínas de la cubierta con el extremo 5' y que la proteína de la cubierta se construye hacia el extremo 3'. [29] Todo el proceso de replicación viral ocurre dentro del retículo endoplasmático . Estas partículas virales recién sintetizadas se transportan posteriormente a través de los plasmodesmos a las células vegetales adyacentes mediante varias proteínas potyvirus asistentes. La distribución de virus dentro de la planta ocurre de acuerdo con la relación fuente-sumidero entre los tejidos en maduración y crecimiento. [30] La concentración de virus en toda la planta es alta y esto aumenta en gran medida la posibilidad de absorción por pulgones. La infección de plantas por potyvirus puede variar en los síntomas mostrados. La infección puede incluir necrosis venosa, síntomas de mosaico, así como malformación de las hojas (Boonham et al., 2002). Las plantas infectadas que no muestran síntomas pueden tener copas infectadas y producirán productos de menor calidad que sus contrapartes sanas.
Dado que el virus PVY NTN causa grandes pérdidas en la producción de papa, es importante investigar la interacción entre el virus Y NTN y la papa. Las variedades de papa sensibles responden a la inoculación con PVY NTN con el desarrollo de síntomas típicos. En las hojas inoculadas, 5 a 7 días después de la inoculación, se desarrollan manchas anulares cloróticas y necróticas. A medida que el virus se propaga por la planta, los síntomas sistémicos se desarrollan en las hojas no inoculadas. 10 días después de la inoculación, aparecen arrugas y clorosis en mosaico, lo que da la apariencia de una palmera (caída de las hojas).
Los mecanismos de defensa viral de las plantas intentarán principalmente restringir el movimiento del virus. En caso de no lograrlo, pueden intentar inducir la muerte celular en el tejido infectado, impidiendo así la propagación de los viriones. [31] Aunque se desconoce el mecanismo preciso de inducción de enfermedades por parte de los potyvirus en las plantas, se sabe que estos virus causan una interrupción significativa de la expresión génica del huésped durante la replicación viral. [32] [33] [34]
Se han estudiado en profundidad los cambios fisiológicos en las plantas de patata como respuesta a la infección por PVY NTN . En las primeras etapas de la infección, es decir, las primeras 12 horas, se ha demostrado que los genes relacionados con la fotosíntesis, los genes implicados en la percepción, la señalización y la respuesta de defensa se expresan de forma diferencial. [34] 24 h después de la inoculación, la cantidad de ácido salicílico aumentó. [35]
Una alteración en la expresión genética altera la función celular normal de las células, lo que podría ser la causa de los síntomas físicos que presenta la planta. En el momento del desarrollo de los síntomas, las investigaciones sobre la interacción entre la variedad de papa susceptible y PVY NTN mostraron cambios en el nivel de citoquininas. [36] En las hojas inoculadas que mostraban síntomas, se detectaron modificaciones en la estructura y el tamaño de los cloroplastos, [37] niveles más bajos de clorofila y actividad diferencial de peroxidasas solubles e iónicas [38] .
En etapas posteriores de la infección por PVY NTN , la concentración de proteína total aumentó en las variedades de papa sensibles, mientras que no se observaron cambios tan pronunciados en las variedades de papa tolerantes y moderadamente tolerantes. [39] Los estudios de expresión genética revelaron cambios en la expresión de genes para proteínas de choque térmico, catalasa, β-1,3-glucanasa y genes involucrados en la fotosíntesis. [33]
Los viriones del potyvirus consisten en estructuras filamentosas sin envoltura que tienen una longitud de 680 a 900 nm y un ancho de 11 a 15 nm. [40] Morfológicamente, la cápside del potyvirus consta de aproximadamente 2000 copias de proteína de cubierta (CP). [30]
La cápside encapsula una sola hebra de ARN de sentido positivo que tiene una longitud del orden de 10 kb y tiene una región terminal 5' no traducida (5'-NTR) así como una cola 3'-poli-A . [41] [42] El genoma de sentido positivo contiene un único marco de lectura abierto extendido y actúa directamente como ARNm. El 5'-NTR de 144 nucleótidos es particularmente rico en residuos de adenina y tiene muy pocos residuos de guanina . En lugar de una estructura de capuchón convencional, el 5'NTR está asociado con una proteína ligada al genoma viral ( VPg ) que se dice que actúa como potenciador de la transcripción. [28]
La secuencia líder 5' tiene un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) y elementos reguladores de la traducción independientes de la caperuza (CIRE). [43] El IRES dirige la traducción independiente de la caperuza a través de un mecanismo similar al utilizado por los eucariotas. [44] El marco de lectura abierto extendido codifica una poliproteína de 350 kDa. Esta poliproteína es procesada proteolíticamente por proteasas virales (NIa, HC-Pro y P1) y sufre escisión co- y postraduccional para producir varias proteínas multifuncionales. Estos incluyen los siguientes: P1 (proteína P1), HCPro (proteína de componente auxiliar), P3 (proteína P3), 6K1 (proteína 1 de 6 kDa), CI (inclusión cilíndrica), 6K2 (proteína 2 de 6 kDa), VPg (proteína viral ligada al genoma), NIaPro (proteína de inclusión nuclear a, dominio de proteinasa), NIb (proteína de inclusión nuclear b) y CP (proteína de cubierta). [30]
En el pasado, los cultivos se inspeccionaban visualmente para determinar si estaban libres de enfermedades o no. La inspección visual también se utilizó como base para la certificación de semillas. La determinación del estado viral mediante inspección visual es increíblemente difícil, ya que los síntomas pueden estar enmascarados o la infección latente. [23] Como resultado, se introdujeron pruebas e inspecciones posteriores a la temporada. Estas pruebas implicaban el cultivo de material previamente cosechado en invernaderos. Las plantas resultantes se inspeccionaban para obtener una estimación más precisa del estado viral. Aunque este método de detección ofrecía cierto grado de seguimiento de la presencia viral, era subjetivo y altamente ineficaz. El análisis inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de cultivos y semillas de papa reemplazó a la inspección visual a principios de la década de 1970. El uso de ELISA ofreció a los laboratorios de diagnóstico de rutina un método rápido, eficaz y sensible de detección de una amplia gama de virus de plantas de papa.
La detección de patógenos mediante ELISA se basa en la interacción entre el antígeno y los anticuerpos específicos y se ha convertido en un medio popular y rentable de detección rutinaria. En un ELISA, la fase sólida se puede recubrir con la muestra de interés que contiene el antígeno. [45] La eficiencia con la que el antígeno se une a la fase sólida depende de la temperatura, la duración de la exposición y la concentración. [45] Las fases sólidas utilizadas incluyen membranas de nitrocelulosa, papel, vidrio, agarosa y placas de microtitulación de poliestireno o cloruro de polivinilo. Las placas de microtitulación son la fase sólida más utilizada porque son fáciles de manipular, permiten la automatización y el análisis mediante lectores de placas de microtitulación. Un inconveniente de estas placas es que son muy absorbentes y esto aumenta la incidencia de la unión no específica de los componentes utilizados en el ELISA. La unión no específica a las placas se reduce mediante el uso de tampones que contienen proteínas como la caseína y detergentes no iónicos como el Tween 20. Después del recubrimiento, se elimina el exceso de muestra y la placa normalmente se trata con una solución que contiene caseína al 1%. Posteriormente, la fase sólida se trata con anticuerpos generados contra el antígeno de interés. Después de cada paso de incubación, la placa se lava con Tween 20 que contiene PBS. Estos pasos de lavado tienen como objetivo eliminar cualquier componente unido de forma no específica. [46] Los componentes unidos de forma no específica se unen con menos fuerza que los unidos de forma específica. La detección se logra mediante la adición de un anticuerpo acoplado a enzima o mediante la adición y detección de un anticuerpo biotinilado. En un sistema que utiliza un anticuerpo acoplado a enzima, la adición posterior de un sustrato apropiado da como resultado la formación de un color proporcional a la cantidad de antígeno. [46] Alternativamente, la placa se puede recubrir con anticuerpo seguido de una incubación con la muestra que se va a detectar. Esto, a su vez, se puede detectar como se describió anteriormente y luego se denomina ELISA de sándwich de doble anticuerpo (DAS). Sin embargo, ambos sistemas tienen una desventaja en que el acoplamiento de la enzima al anticuerpo puede dar como resultado un impedimento estérico que, a su vez, puede dar como resultado una pérdida de función del anticuerpo y/o la enzima. [47] Esto se puede superar mediante el uso de un puente biotina-avidina o biotina-estreptavidina. En este tipo de sistema, la biotinaLa biotina está acoplada al anticuerpo. La molécula de biotina no tiene ninguna influencia en el funcionamiento de los anticuerpos y se detecta fácilmente utilizando avidina o estreptavidina conjugadas con una enzima adecuada. La estreptavidina tiene una afinidad extremadamente alta por la biotina, lo que da como resultado un grado de especificidad aún mayor que un sistema en el que la enzima está acoplada directamente al antígeno. Para determinar si el antígeno está presente o no, se agrega un sustrato específico para la enzima utilizada. A continuación, la enzima convierte el sustrato en un producto coloreado y la intensidad del color se puede correlacionar con la cantidad de anticuerpos unidos y, por lo tanto, con la cantidad de antígeno presente. Un DAS-ELISA tiene la ventaja de que puede aumentar la especificidad del ELISA y reducir la aparición de uniones no específicas. Como resultado, el principio DAS-ELISA se utiliza comúnmente en ELISA para la detección de patógenos de plantas en la savia de la planta sin purificación previa del patógeno.
El ELISA se considera un método seguro, económico y rápido para la detección de virus de plantas. Su bajo costo y relativa simplicidad permiten que se utilice como herramienta de trabajo en el sector agrícola y se utiliza para analizar miles de muestras por año. Desafortunadamente, los ELISA no son completamente infalibles. Los niveles de virus en los tubérculos de papa, que se analizan mediante ELISA para su uso como papas de semilla, normalmente son bajos mientras los tubérculos están inactivos. La detección de virus mediante ELISA en estas papas es difícil y los valores de absorbancia pueden caer por debajo del valor de corte establecido. Por esta razón, el análisis de tubérculos de semilla se realiza en tubérculos en germinación en lugar de tubérculos inactivos. Aunque esto da como resultado lecturas más confiables que el análisis directo de tubérculos, retrasa la certificación de las papas de semilla. [48] Otra desventaja de un método de detección basado en inmunología es que los cambios a nivel genético pueden tener una influencia en la inmunogenicidad del antígeno que se va a detectar. En términos de virus de plantas de papa, las mutaciones dentro del gen CP pueden hacer que el CP experimente cambios conformacionales, lo que hace que los anticuerpos producidos contra el virus previamente presente sean menos efectivos.
La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se ha convertido en un método potente y eficaz para la detección de virus de la planta de la patata en el material vegetal de la patata e incluso en patatas latentes. Para el análisis mediante RT-PCR sólo se necesita un minúsculo trozo de material vegetal. Teniendo en cuenta el protocolo descrito en esta tesis, 0,1 g de material vegetal son suficientes para 14.500 reacciones independientes. Durante una RT-PCR, las secuencias de ARN diana específicas se amplifican exponencialmente en copias de ADN. Sin embargo, para que esto ocurra, el ARN del virus debe transcribirse primero en ADN por medio de una polimerasa con transcriptasa inversa. Esta polimerasa sintetiza una cadena de ADN utilizando el ARN como plantilla. Esto da como resultado un complejo ADN/ARN. Para la síntesis de una cadena de ADN a partir de la plantilla de ARN sólo se necesita el cebador inverso, ya que el ARN es una cadena sencilla dispuesta de 5' a 3'. Posteriormente, la cadena de ADN recién sintetizada se utiliza como plantilla para la PCR tradicional.
Existen diferentes tipos de polimerasas de transcriptasa inversa disponibles para satisfacer diferentes necesidades y condiciones de reacción. Las enzimas de transcriptasa inversa que se utilizan comúnmente incluyen AMV RT, SuperScript III, ImProm-II, Omniscript, Sensiscript y Tth RT. Al final del paso de RT, la enzima polimerasa se activa por calor. También podría ser que la polimerasa de transcriptasa inversa y la ADN polimerasa sean una y la misma enzima y que la enzima solo requiera un paso de activación de la ADN polimerasa después del paso de RT. Un ejemplo de una enzima de este tipo es la polimerasa Tth. Esta enzima tiene actividad de transcriptasa inversa dependiente de ARN y de polimerasa dependiente de ADN. Sin embargo, el centro activo de la ADN polimerasa está cubierto por oligonucleótidos dedicados , llamados aptámeros . A temperaturas inferiores a la temperatura de reacción óptima, el componente de polimerasa dependiente de ADN de Tth permanece cubierto por los aptámeros. A estas temperaturas, la enzima Tth solo sintetiza una copia de ADN de la plantilla de ARN. Una vez que la temperatura de reacción se eleva a 95 °C, los aptámeros se eliminan y el componente de polimerasa dependiente de ADN comenzará a amplificar la secuencia objetivo.
La amplificación por PCR del ADN diana se produce en tres pasos: desnaturalización , annealing y extensión. [46] Cada uno de estos pasos se produce a una temperatura específica durante un período de tiempo fijo. La desnaturalización normalmente se permite que ocurra entre 90 y 95 °C y conduce a la disociación de las cadenas de ADN. Después de esto, la reacción se enfría entre 40 y 70 °C para permitir que los cebadores se asocien con sus respectivas secuencias diana. Este paso se conoce como el paso de annealing y es específico del cebador. La temperatura a la que se annealizan los cebadores es crítica. Temperaturas demasiado altas no permitirían que los cebadores se asocien con el ADN, lo que daría como resultado una amplificación nula o deficiente. Una temperatura de annealing demasiado baja conduciría en última instancia a una unión no específica de los cebadores y una amplificación no específica. [46] Los cebadores unidos a las regiones que flanquean el ADN diana proporcionan grupos 3'-hidroxilo para la extensión catalizada por la ADN polimerasa. La ADN polimerasa más utilizada es la Taq , una enzima termoestable aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus . La ADN polimerasa sintetiza nuevas cadenas de ADN a lo largo de las cadenas molde, utilizando los cebadores como puntos de partida. Durante el paso de extensión, las cadenas se amplifican más allá del ADN objetivo. Esto significa que cada cadena de ADN recién sintetizada tendrá una región complementaria a un cebador. Hay un aumento exponencial en la cantidad de ADN producido a medida que los tres pasos mencionados anteriormente se repiten de forma cíclica. En una PCR tradicional, estos pasos pueden repetirse entre 20 y 55 veces. Sin embargo, un problema con la amplificación por PCR es que la temperatura requerida para la disociación de la cadena de ADN también da como resultado la desnaturalización de la ADN polimerasa. Esto se supera parcialmente mediante la bioingeniería de polimerasas que son más estables térmicamente y tienen vidas medias más largas.
Aunque la RT-PCR es técnicamente más difícil de realizar y más cara que la ELISA, tiene la capacidad de permitir la detección de cargas virales bajas. Se considera que la RT-PCR es entre 102 y 105 veces más sensible que la ELISA tradicional. [49] La RT-PCR también permite la detección de varios objetivos virales en la misma reacción mediante el uso de varias combinaciones de cebadores. Esto se llama multiplexación. Aunque la multiplexación es técnicamente más exigente que una reacción simplex tradicional, permite un mayor rendimiento en el sentido de que una sola muestra se puede analizar para varias cepas virales en una sola reacción. Los cebadores utilizados para la multiplexación se eligen de tal manera que den como resultado amplicones de varios tamaños. Esto permite el análisis posterior a la RT-PCR mediante electroforesis en gel. Aunque la RT-PCR ahorra tiempo, permite la multiplexación y es más sensible que la ELISA, los reactivos y la instrumentación necesarios son caros y requieren un mayor nivel de experiencia técnica. Además, el análisis del producto final mediante electroforesis en gel es laborioso, relativamente más caro, requiere mucho tiempo y no se presta a la automatización. Por estas razones, el uso de RT-PCR para el cribado de rutina no es viable y no ha sustituido a la ELISA. Sin embargo, ofrece a la industria la oportunidad de detectar casos límite, especialmente en el caso de la certificación de semillas de patata.
En la mayoría de las PCR tradicionales, los productos resultantes se analizan después de que se haya completado la PCR. Esto se llama análisis de punto final y normalmente es de naturaleza cualitativa en lugar de cuantitativo. Para este tipo de análisis, los productos se analizan principalmente en un gel de agarosa y se visualizan utilizando bromuro de etidio como tinte fluorescente . La correlación directa entre la intensidad de la señal y la concentración inicial de la muestra no es posible utilizando el análisis de punto final, ya que la eficiencia de la PCR disminuye a medida que la reacción se acerca a la fase de meseta. Sin embargo, la PCR cuantitativa ofrece una alternativa precisa y rápida a la PCR tradicional. La PCR cuantitativa ofrece al investigador la oportunidad de amplificar y analizar el producto en un solo tubo utilizando tintes fluorescentes. Esto se conoce como PCR homogénea. Durante una PCR cuantitativa, el aumento de la fluorescencia se correlaciona con el aumento del producto. Mediante el uso de diferentes tintes específicos, la PCR cuantitativa se puede utilizar para distinguir entre diferentes cepas de un virus e incluso para detectar mutaciones puntuales. La principal ventaja de la PCR cuantitativa es que no se requiere el análisis de los productos resultantes mediante electroforesis en gel. Esto significa que la PCR cuantitativa se puede implementar como una técnica de alto rendimiento para el cribado de muestras.
Se ha descrito la PCR cuantitativa para la detección [50] y discriminación de aislamientos PVY O y PVY N [51] [52] y para la discriminación confiable entre aislamientos PVY NTN y PVY N. [53]