Un espliceosoma es un gran complejo de ribonucleoproteína (RNP) que se encuentra principalmente dentro del núcleo de las células eucariotas . El espliceosoma se ensambla a partir de pequeños ARN nucleares ( snRNA ) y numerosas proteínas. Pequeñas moléculas de ARN nuclear (snRNA) se unen a proteínas específicas para formar un pequeño complejo de ribonucleoproteína nuclear (snRNP, pronunciado “snurps”), que a su vez se combina con otros snRNP para formar un gran complejo de ribonucleoproteína llamado espliceosoma. El espliceosoma elimina los intrones de un pre-ARNm transcrito , un tipo de transcripción primaria . Este proceso generalmente se conoce como empalme . [1] Una analogía es un editor de películas, que recorta selectivamente material irrelevante o incorrecto (equivalente a los intrones ) de la película inicial y envía la versión limpia al director para el montaje final.
Sin embargo, a veces el ARN dentro del intrón actúa como una ribozima, empalmándose sin el uso de un espliceosoma o enzimas proteicas.
En 1977, el trabajo de los laboratorios Sharp y Roberts reveló que los genes de organismos superiores están "divididos" o presentes en varios segmentos distintos a lo largo de la molécula de ADN. [2] [3] Las regiones codificantes del gen están separadas por ADN no codificante que no participa en la expresión de proteínas. La estructura del gen dividido se encontró cuando los ARNm adenovirales se hibridaron con fragmentos de escisión por endonucleasa de ADN viral monocatenario. [2] Se observó que los ARNm de los híbridos ARNm-ADN contenían colas 5' y 3' de regiones sin enlaces de hidrógeno. Cuando se utilizaron fragmentos más grandes de ADN viral, se observaron estructuras bifurcadas de ADN en bucle cuando se hibridaron con los ARNm virales. Se descubrió que las regiones enlazadas, los intrones , se eliminan de los ARNm precursores en un proceso que Sharp denominó "empalme". Posteriormente se descubrió que la estructura genética dividida era común a la mayoría de los genes eucariotas . Phillip Sharp y Richard J. Roberts recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1993 por el descubrimiento de los intrones y el proceso de empalme.
Cada espliceosoma está compuesto por cinco pequeños ARN nucleares (snRNA) y una variedad de factores proteicos asociados. Cuando estos pequeños ARN se combinan con los factores proteicos, forman complejos ARN-proteína llamados snRNP ( pequeñas proteínas de ribonucleonucleares , pronunciadas " snurps" ) . Los snRNA que forman el espliceosoma principal se denominan U1 , U2 , U4 , U5 y U6 , llamados así porque son ricos en uridina y participan en varias interacciones ARN-ARN y ARN-proteína. [1]
El ensamblaje del espliceosoma ocurre en cada pre-ARNm (también conocido como ARN nuclear heterogéneo, hn-ARN) en cada unión exón:intrón. Los intrones de pre-ARNm contienen elementos de secuencia específicos que se reconocen y utilizan durante el ensamblaje del espliceosoma. Estos incluyen el sitio de empalme del extremo 5', la secuencia del punto de ramificación, el tracto de polipirimidina y el sitio de empalme del extremo 3'. El espliceosoma cataliza la eliminación de intrones y la ligadura de los exones flanqueantes.
Los intrones suelen tener una secuencia de nucleótidos GU en el sitio de empalme del extremo 5' y una AG en el sitio de empalme del extremo 3'. El sitio de empalme 3' puede definirse además por una longitud variable de polipirimidinas, llamada tracto de polipirimidina (PPT), que cumple la doble función de reclutar factores para el sitio de empalme 3' y posiblemente reclutar factores para la secuencia del punto de ramificación (BPS). . El BPS contiene la adenosina conservada necesaria para el primer paso del empalme.
Muchas proteínas exhiben un motivo de unión al zinc, lo que subraya la importancia del zinc en el mecanismo de empalme. [4] [5] [6] La primera reconstrucción con resolución molecular del complejo triple de ribonucleoproteína nuclear pequeña (tri-snRNP) U4/U6.U5 se informó en 2016. [7]
Shi et al. han aplicado ampliamente Cryo-EM. para dilucidar la estructura casi atómica del espliceosoma tanto en levaduras [9] como en humanos. [10] La estructura molecular del espliceosoma con resolución casi atómica demuestra que el componente Spp42 de U5 snRNP forma una estructura central y ancla el centro catalítico en la levadura. La estructura atómica del espliceosoma humano ilustra el componente del paso II. Slu7 adopta una estructura extendida, preparada para la selección del sitio de empalme 3'. Los cinco metales (asignados como Mg2+) en el complejo de levadura se conservan en el complejo humano.
El empalme alternativo (la recombinación de diferentes exones ) es una fuente importante de diversidad genética en eucariotas. Se han utilizado variantes de empalme para explicar el número relativamente pequeño de genes que codifican proteínas en el genoma humano , estimado actualmente en alrededor de 20.000. Se ha especulado que un gen particular de Drosophila , Dscam , se puede empalmar alternativamente en 38.000 ARNm diferentes , suponiendo que todos sus exones se puedan empalmar independientemente unos de otros. [11]
El modelo para la formación del sitio activo del espliceosoma implica un ensamblaje ordenado y gradual de partículas snRNP discretas en el sustrato de pre-ARNm. El primer reconocimiento de los pre-ARNm implica la unión del snRNP U1 al sitio de empalme del extremo 5' del pre-ARNm y otros factores no asociados al snRNP para formar el complejo de compromiso, o complejo temprano (E) en los mamíferos. [12] [13] El complejo de compromiso es un complejo independiente de ATP que compromete el pre-ARNm con la vía de empalme. [14] U2 snRNP se recluta en la región de rama a través de interacciones con el componente del complejo E U2AF (factor auxiliar U2 snRNP) y posiblemente U1 snRNP. En una reacción dependiente de ATP, el snRNP de U2 se asocia estrechamente con la secuencia de punto de ramificación (BPS) para formar el complejo A. Un dúplex formado entre el snRNP de U2 y la región de ramificación del pre-ARNm sobresale de la rama de adenosina, especificándola como el nucleófilo para la Primera transesterificación. [15]
La presencia de un residuo de pseudouridina en el ARNsn de U2, casi opuesto al sitio de ramificación, da como resultado una conformación alterada del dúplex ARN-ARN tras la unión del snRNP de U2. Específicamente, la estructura alterada del dúplex inducida por la pseudouridina coloca el 2' OH de la adenosina abombada en una posición favorable para el primer paso del empalme. [16] El tri-snRNP U4/U5/U6 (ver Figura 1) se recluta en el espliceosoma en ensamblaje para formar el complejo B y, después de varios reordenamientos, el complejo C se activa para la catálisis. [17] [18] No está claro cómo se recluta el tri-snRNP en el complejo A, pero este proceso puede estar mediado a través de interacciones proteína-proteína y/o interacciones de emparejamiento de bases entre el snRNA U2 y el snRNA U6.
El snRNP U5 interactúa con secuencias en los sitios de empalme 5' y 3' a través del bucle invariante del ARNsn U5 [19] y los componentes de la proteína U5 interactúan con la región del sitio de empalme 3'. [20]
Tras el reclutamiento del tri-snRNP, varios reordenamientos de ARN-ARN preceden al primer paso catalítico y se producen más reordenamientos en el espliceosoma catalíticamente activo. Varias de las interacciones ARN-ARN son mutuamente excluyentes; sin embargo, no se sabe qué desencadena estas interacciones ni el orden de estos reordenamientos. El primer reordenamiento es probablemente el desplazamiento del snRNP U1 del sitio de empalme 5' y la formación de una interacción de snRNA U6. Se sabe que el snRNP U1 sólo está débilmente asociado con los espliceosomas completamente formados, [21] y el snRNP U1 inhibe la formación de una interacción del sitio de empalme U6-5' en un modelo de oligonucleótido sustrato que contiene un exón 5' corto y un exón 5' corto. sitio de empalme. [22] La unión de U2 snRNP a la secuencia de punto de ramificación (BPS) es un ejemplo de una interacción ARN-ARN que desplaza una interacción proteína-ARN. Tras el reclutamiento de U2 snRNP, la proteína de unión a rama SF1 en el complejo de compromiso se desplaza ya que el sitio de unión de U2 snRNA y SF1 son eventos mutuamente excluyentes.
Dentro del ARNsn U2, existen otros reordenamientos mutuamente excluyentes que ocurren entre conformaciones en competencia. Por ejemplo, en la forma activa, se prefiere el bucle de tallo IIa; en la forma inactiva predomina una interacción mutuamente excluyente entre el bucle y una secuencia descendente. [18] No está claro cómo se desplaza U4 del ARNsn U6, aunque el ARN ha sido implicado en el ensamblaje del espliceosoma y puede funcionar para desenrollar U4/U6 y promover la formación de una interacción ARNsn U2/U6. Las interacciones de los bucles de vástago I y II de U4/U6 se disocian y la región liberada del bucle de vástago II de U6 se pliega sobre sí misma para formar un bucle de vástago intramolecular y U4 ya no se requiere en un ensamblaje adicional de espliceosoma. La región del bucle del tallo I liberada de U6 se empareja con el ARNsn de U2 formando la hélice I U2/U6. Sin embargo, la estructura de la hélice I es mutuamente excluyente con la mitad 3' de una región del bucle del tallo interno 5' del ARNsn de U2.
Algunos eucariotas tienen un segundo espliceosoma, el llamado espliceosoma menor . [23] Un grupo de snRNA menos abundantes, U11 , U12 , U4atac y U6atac , junto con U5, son subunidades del espliceosoma menor que empalma una clase rara de intrones de pre-ARNm, denominados tipo U12. El espliceosoma menor está ubicado en el núcleo como su contraparte mayor, [24] aunque hay excepciones en algunas células especializadas, incluidas las plaquetas anucleadas [25] y el dendroplasma ( citoplasma dendrítico ) de las células neuronales. [26]
