El sistema de modificación de restricción ( sistema RM ) se encuentra en bacterias y arqueas , y proporciona una defensa contra el ADN extraño , como el que transportan los bacteriófagos .
Las bacterias tienen enzimas de restricción , también llamadas endonucleasas de restricción , que escinden el ADN bicatenario en puntos específicos en fragmentos, que luego son degradados por otras endonucleasas . Esto previene la infección al destruir eficazmente el ADN extraño introducido por un agente infeccioso (como un bacteriófago ). Aproximadamente una cuarta parte de las bacterias conocidas poseen sistemas RM y de ellas, aproximadamente la mitad tiene más de un tipo de sistema.
Como las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción son muy cortas, es casi seguro que la bacteria misma contendrá algunas dentro de su genoma. Para evitar que las enzimas de restricción destruyan su propio ADN, se añaden grupos metilo . Estas modificaciones no deben interferir con el apareamiento de bases del ADN y, por lo tanto, normalmente solo se modifican unas pocas bases específicas en cada hebra.
Las endonucleasas rompen enlaces fosfodiéster internos/no terminales. Lo hacen solo después de reconocer secuencias específicas en el ADN que suelen tener entre 4 y 6 pares de bases de longitud y, a menudo, son palindrómicas .
El sistema RM fue descubierto por primera vez por Salvatore Luria y Mary Human en 1952 y 1953. [1] [2] Encontraron que un bacteriófago que crece dentro de una bacteria infectada podría ser modificado, de modo que al liberarse y reinfectar una bacteria relacionada, el crecimiento del bacteriófago se restringe (inhibe; también descrito por Luria en su autobiografía en las páginas 45 y 99 en 1984). [3] En 1953, Jean Weigle y Giuseppe Bertani informaron ejemplos similares de modificación controlada por el huésped utilizando diferentes sistemas de bacteriófagos. [4] El trabajo posterior de Daisy Roulland-Dussoix y Werner Arber en 1962 [5] y muchos otros investigadores posteriores llevaron a la comprensión de que la restricción se debía al ataque y la descomposición del ADN del bacteriófago modificado por enzimas específicas de la bacteria receptora. Trabajos posteriores de Hamilton O. Smith aislaron HinDII, la primera de la clase de enzimas ahora conocidas como enzimas de restricción , mientras que Daniel Nathans demostró que puede usarse para el mapeo de restricción . [6] Cuando estas enzimas se aislaron en el laboratorio, pudieron usarse para la manipulación controlada del ADN, proporcionando así la base para el desarrollo de la ingeniería genética . Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1978 por su trabajo sobre la modificación de la restricción. [ cita requerida ]
Existen cuatro categorías de sistemas de modificación de la restricción: tipo I, tipo II, tipo III y tipo IV. [7] Todos tienen actividad enzimática de restricción y una actividad de metilasa (excepto el tipo IV que no tiene actividad de metilasa). Se nombraron en el orden de descubrimiento, aunque el sistema de tipo II es el más común. [7]
Los sistemas de tipo I son los más complejos y constan de tres polipéptidos: R (restricción), M (modificación) y S (especificidad). El complejo resultante puede escindir y metilar el ADN. Ambas reacciones requieren ATP y la escisión suele producirse a una distancia considerable del sitio de reconocimiento. La subunidad S determina la especificidad tanto de la restricción como de la metilación. La escisión se produce a distancias variables de la secuencia de reconocimiento, por lo que las bandas discretas no se visualizan fácilmente mediante electroforesis en gel . [ cita requerida ]
Los sistemas de tipo II son los más simples y los más frecuentes. [8] En lugar de funcionar como un complejo, la metiltransferasa y la endonucleasa se codifican como dos proteínas separadas y actúan de forma independiente (no hay proteína de especificidad). Ambas proteínas reconocen el mismo sitio de reconocimiento y, por lo tanto, compiten por la actividad. La metiltransferasa actúa como un monómero , metilando el dúplex una hebra a la vez. La endonucleasa actúa como un homodímero , lo que facilita la escisión de ambas hebras. La escisión se produce en una posición definida cerca o dentro de la secuencia de reconocimiento, produciendo así fragmentos discretos durante la electroforesis en gel. Por esta razón, los sistemas de tipo II se utilizan en laboratorios para el análisis de ADN y la clonación de genes . [ cita requerida ]
Los sistemas de tipo III tienen proteínas R (res) y M (mod) que forman un complejo de modificación y escisión. La proteína M, sin embargo, puede metilarse por sí sola. La metilación también ocurre solo en una hebra del ADN, a diferencia de la mayoría de los otros mecanismos conocidos. El heterodímero formado por las proteínas R y M compite consigo mismo modificando y restringiendo la misma reacción. Esto da como resultado una digestión incompleta. [9] [10]
Los sistemas de tipo IV no son verdaderos sistemas RM porque solo contienen una enzima de restricción y no una metilasa. A diferencia de los otros tipos, las enzimas de restricción de tipo IV reconocen y cortan solo el ADN modificado. [11]
Neisseria meningitidis tiene múltiples sistemas de endonucleasas de restricción de tipo II que se emplean en la transformación genética natural . La transformación genética natural es un proceso por el cual una célula bacteriana receptora puede tomar ADN de una célula bacteriana donante vecina e integrar este ADN en su genoma por recombinación. Aunque los primeros trabajos sobre sistemas de modificación por restricción se centraron en el beneficio para las bacterias de protegerse contra el ADN de bacteriófagos invasores u otro ADN extraño, ahora se sabe que estos sistemas también se pueden utilizar para restringir el ADN introducido por transformación natural de otros miembros de la misma especie o de especies relacionadas. [ cita requerida ]
En la bacteria patógena Neisseria meningitidis (meningococos), la competencia para la transformación es un proceso altamente evolucionado y complejo donde múltiples proteínas en la superficie bacteriana, en las membranas y en el citoplasma interactúan con el ADN transformante entrante. Los sistemas de restricción-modificación son abundantes en el género Neisseria . N. meningitidis tiene múltiples sistemas de endonucleasas de restricción de tipo II. [12] Los sistemas de restricción-modificación en N. meningitidis varían en especificidad entre diferentes clados. [12] [13] Esta especificidad proporciona una barrera eficiente contra el intercambio de ADN entre clados. [12] Luria, en la página 99 de su autobiografía, [3] se refirió a tal comportamiento de restricción como "un ejemplo extremo de hostilidad". La restricción-modificación parece ser un impulsor principal del aislamiento sexual y la especiación en los meningococos. [14] Caugant y Maiden [15] sugirieron que los sistemas de restricción-modificación en meningococos pueden actuar para permitir el intercambio genético entre parientes muy cercanos mientras reducen (pero no previenen por completo) el intercambio genético entre meningococos que pertenecen a diferentes complejos clonales y especies relacionadas. [ cita requerida ]
Los sistemas RM también pueden actuar como elementos genéticos egoístas , forzando su mantenimiento en la célula a través de la muerte celular post-segregacional. [16]
Algunos virus han desarrollado formas de subvertir el sistema de modificación de la restricción, generalmente modificando su propio ADN, añadiéndole grupos metilo o glicosilo , bloqueando así las enzimas de restricción. Otros virus, como los bacteriófagos T3 y T7, codifican proteínas que inhiben las enzimas de restricción. [ cita requerida ]
Para contrarrestar estos virus, algunas bacterias han desarrollado sistemas de restricción que sólo reconocen y cortan el ADN modificado, pero no actúan sobre el ADN no modificado del huésped. Algunos procariotas han desarrollado múltiples tipos de sistemas de restricción y modificación. [ cita requerida ]
Los sistemas RM son más abundantes en especies promiscuas, en las que establecen rutas preferenciales de intercambio genético dentro y entre linajes con sistemas RM afines. [17] Debido a que el repertorio y/o la especificidad de los sistemas RM en linajes bacterianos varían rápidamente, se espera que los flujos preferenciales de transferencia genética dentro de las especies cambien constantemente, produciendo redes de transferencia genética dependientes del tiempo. [ cita requerida ]
(a) Clonación: los sistemas RM pueden clonarse en plásmidos y seleccionarse debido a la resistencia que proporciona la enzima de metilación. Una vez que el plásmido comienza a replicarse, se producirá la enzima de metilación y metilará el ADN del plásmido, protegiéndolo de una enzima de restricción específica. [ cita requerida ]
(b) Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción: Las enzimas de restricción también se utilizan para analizar la composición del ADN en relación con la presencia o ausencia de mutaciones que afectan la especificidad de escisión de las REasas. Cuando se analizan los genes de tipo salvaje y mutantes mediante digestión con diferentes REasas, los productos de la electroforesis en gel varían en longitud, en gran medida porque los genes mutantes no se escindirán en un patrón similar al de los de tipo salvaje debido a la presencia de mutaciones que hacen que las REasas no sean específicas para la secuencia mutante. [ cita requerida ]
El sistema RM de las bacterias se ha propuesto como modelo para diseñar vacunas y terapias antivirales humanas, ya que el sistema RM cumple una función de defensa innata en las bacterias al restringir el tropismo de los bacteriófagos. [18] La investigación se centra en las REases y ZFN que pueden escindir el ADN de varios virus humanos, incluidos HSV-2 , HPV de alto riesgo y VIH-1 , con el objetivo final de inducir mutagénesis dirigida y aberraciones de virus que infectan a humanos. [19] [20] [21] El genoma humano ya contiene restos de genomas retrovirales que han sido inactivados y aprovechados para beneficio propio. De hecho, los mecanismos para silenciar los retroelementos genómicos L1 activos por la exonucleasa de reparación de tres elementos principales 1 (TREX1) y la reparación por escisión complementaria cruzada 1 (ERCC) parecen imitar la acción de los sistemas RM en bacterias y la unión de extremos no homólogos (NHEJ) que sigue al uso de ZFN sin una plantilla de reparación. [22] [23]
Un avance importante es la creación de enzimas de restricción artificiales creadas mediante la unión del dominio de escisión del ADN FokI con una matriz de proteínas de unión al ADN o matrices de dedos de zinc, denominadas ahora como nucleasas de dedos de zinc (ZFN). [24] Las ZFN son una herramienta poderosa para la edición del genoma del huésped debido a su especificidad de secuencia mejorada. Las ZFN funcionan en pares, y su dimerización se media in situ a través del dominio FoKI. Cada matriz de dedos de zinc (ZFA) es capaz de reconocer de 9 a 12 pares de bases, lo que da como resultado 18 a 24 para el par. Un espaciador de 5 a 7 pb entre los sitios de escisión mejora aún más la especificidad de las ZFN, lo que las convierte en una herramienta segura y más precisa que se puede aplicar en humanos. Recientemente se ha llevado a cabo un ensayo clínico de fase I de ZFN para la abolición dirigida del correceptor CCR5 para el VIH-1. [25]
Los sistemas RM son actores principales en la interacción coevolutiva entre elementos genéticos móviles (MGE) y sus hospedadores. [26] Se ha informado que los genes que codifican sistemas RM se mueven entre genomas procariotas dentro de MGE, como plásmidos, profagos, secuencias de inserción/transposones, elementos conjugativos integradores (ICE) e integrones. Sin embargo, recientemente se descubrió que hay relativamente pocos sistemas RM en plásmidos, algunos en profagos y prácticamente ninguno en fagos. Por otro lado, todos estos MGE codifican una gran cantidad de genes RM solitarios, en particular MTasas. [26] A la luz de esto, es probable que la movilidad de los RM pueda depender menos de los MGE y más, por ejemplo, de la existencia de pequeños puntos calientes de integración genómica. También es posible que los sistemas RM exploten con frecuencia otros mecanismos como la transformación natural, vesículas, nanotubos, agentes de transferencia genética o transducción generalizada para moverse entre genomas. [ cita requerida ]