Recipiente quimiostato cerrado con entrada continua y ajustable de medio y salida de efluente, utilizado para el crecimiento controlado de microorganismos. El sistema mantiene un volumen y nivel de aireación constantes. La tasa de crecimiento del microorganismo se controla mediante la manipulación de la entrada de medio fresco, mientras que la densidad de población se regula cambiando la concentración del nutriente limitante. Este sistema abierto permite a los investigadores mantener la fase de crecimiento exponencial de las células para su uso en experimentos fisiológicos. [1]
Un quimiostato (el entorno químico es estático ) es un biorreactor al que se agrega continuamente medio fresco, mientras que el líquido de cultivo que contiene nutrientes sobrantes, productos metabólicos finales y microorganismos se elimina continuamente a la misma velocidad para mantener constante el volumen de cultivo. [2] [3] Al cambiar la velocidad con la que se agrega el medio al biorreactor, la tasa de crecimiento específica del microorganismo se puede controlar fácilmente dentro de ciertos límites.
Operación
Estado estable
Una de las características más importantes de los quimiostatos es que los microorganismos pueden crecer en un estado fisiológico estable bajo condiciones ambientales constantes. En este estado estacionario, el crecimiento se produce a una tasa de crecimiento específica constante y todos los parámetros del cultivo permanecen constantes (volumen de cultivo, concentración de oxígeno disuelto, concentraciones de nutrientes y productos, pH, densidad celular, etc.). Además, el experimentador puede controlar las condiciones ambientales. [4] Los microorganismos que crecen en quimiostatos generalmente alcanzan un estado estacionario debido a una retroalimentación negativa entre la tasa de crecimiento y el consumo de nutrientes: si hay un número bajo de células presentes en el biorreactor, las células pueden crecer a tasas de crecimiento superiores a la tasa de dilución a medida que crecen. consume pocos nutrientes para que el crecimiento esté menos limitado mediante la adición de nutrientes limitantes con el medio fresco entrante. El nutriente limitante es un nutriente esencial para el crecimiento, presente en el medio en una concentración limitante (todos los demás nutrientes suelen suministrarse en exceso). Sin embargo, cuanto mayor es el número de células, más nutrientes se consumen, lo que reduce la concentración del nutriente limitante. A su vez, esto reducirá la tasa de crecimiento específica de las células, lo que conducirá a una disminución en el número de células a medida que siguen siendo eliminadas del sistema con el flujo de salida. Esto da como resultado un estado estacionario. Debido a la autorregulación, el estado estacionario es estable. Esto permite al experimentador controlar la tasa de crecimiento específica de los microorganismos cambiando la velocidad de la bomba que alimenta medio fresco al recipiente.
Bien mezclada
Otra característica importante de los quimiostatos y otros sistemas de cultivo continuo es que están bien mezclados de modo que las condiciones ambientales sean homogéneas o uniformes y los microorganismos se dispersen aleatoriamente y se encuentren entre sí al azar. Por lo tanto, la competencia y otras interacciones en el quimiostato son globales, a diferencia de las biopelículas .
Tasa de dilución
La tasa de intercambio de nutrientes se expresa como la tasa de dilución D. En estado estacionario, la tasa de crecimiento específica μ del microorganismo es igual a la tasa de dilución D. La tasa de dilución se define como el flujo de medio por unidad de tiempo, F , sobre el volumen V de cultivo en el biorreactor.
Tasa de crecimiento máxima y tasa de dilución crítica
La tasa de crecimiento específica μ está inversamente relacionada con el tiempo que tarda la biomasa en duplicarse, llamado tiempo de duplicación t d , por:
Por lo tanto, el tiempo de duplicación t d pasa a ser función de la tasa de dilución D en estado estacionario:
Cada microorganismo que crece en un sustrato particular tiene una tasa de crecimiento específica máxima μ max (la tasa de crecimiento observada si el crecimiento está limitado por restricciones internas en lugar de nutrientes externos). Si se elige una tasa de dilución superior a μ max , las células no pueden crecer a una velocidad tan rápida como la velocidad a la que se eliminan, por lo que el cultivo no podrá mantenerse en el biorreactor y se eliminará.
Sin embargo, dado que la concentración del nutriente limitante en el quimiostato no puede exceder la concentración en el alimento, la tasa de crecimiento específico que las células pueden alcanzar en el quimiostato suele ser ligeramente menor que la tasa de crecimiento específico máxima porque la tasa de crecimiento específico generalmente aumenta con el nutriente. concentración como se describe por la cinética de la ecuación de Monod . [ cita necesaria ] Las tasas de crecimiento específico más altas ( μ max ) que las células pueden alcanzar son iguales a la tasa de dilución crítica ( D ' c ):
donde S es la concentración de sustrato o nutriente en el quimiostato y K S es la constante de media saturación (esta ecuación asume una cinética de Monod).
Aplicaciones
Investigación
Los quimiostatos en la investigación se utilizan en investigaciones de biología celular, como fuente de grandes volúmenes de células uniformes o proteínas. El quimiostato se utiliza a menudo para recopilar datos sobre el estado estacionario de un organismo con el fin de generar un modelo matemático relacionado con sus procesos metabólicos. Los quimiostatos también se utilizan como microcosmos en ecología [5] [6] y biología evolutiva. [7] [8] [9] [10] En un caso, la mutación/selección es una molestia, en el otro caso, es el proceso deseado en estudio. Los quimiostatos también se pueden utilizar para enriquecer tipos específicos de mutantes bacterianos en cultivo, como auxótrofos o aquellos que son resistentes a antibióticos o bacteriófagos para estudios científicos adicionales. [11] Las variaciones en la tasa de dilución permiten el estudio de las estrategias metabólicas seguidas por los organismos a diferentes tasas de crecimiento. [12] [13]
La competencia por recursos únicos y múltiples, la evolución de las vías de adquisición y utilización de recursos, la alimentación cruzada/simbiosis, [14] [15] el antagonismo, la depredación y la competencia entre depredadores se han estudiado en ecología y biología evolutiva utilizando quimiostatos. [16] [17] [18]
Industria
Los quimiostatos se utilizan con frecuencia en la fabricación industrial de etanol . En este caso, se utilizan varios quimiostatos en serie, cada uno de ellos mantenido a concentraciones de azúcar decrecientes. [ cita necesaria ] El quimiostato también sirve como modelo experimental de cultivos celulares continuos en la industria biotecnológica. [13]
Preocupaciones técnicas
La formación de espuma provoca un desbordamiento y el volumen de líquido no es exactamente constante.
Las células pueden crecer en las paredes o adherirse a otras superficies, [19] lo que puede solucionarse tratando las paredes de vidrio del recipiente con un silano para volverlas hidrófobas. Sin embargo, se seleccionarán celdas para su fijación a las paredes, ya que aquellas que lo hagan no se eliminarán del sistema. Aquellas bacterias que se adhieren firmemente a las paredes formando una biopelícula son difíciles de estudiar en condiciones quimiostáticas.
Es posible que la mezcla no sea realmente uniforme, lo que altera la propiedad "estática" del quimiostato.
El goteo del medio en la cámara en realidad da como resultado pequeños pulsos de nutrientes y, por lo tanto, oscilaciones en las concentraciones, alterando nuevamente la propiedad "estática" del quimiostato.
Las bacterias viajan río arriba con bastante facilidad. Llegarán rápidamente al depósito de medio estéril a menos que el camino del líquido sea interrumpido por una ruptura de aire en la que el medio cae en gotas a través del aire.
Los esfuerzos continuos para remediar cada defecto conducen a variaciones del quimiostato básico con bastante regularidad. Los ejemplos en la literatura son numerosos.
Los agentes antiespumantes se utilizan para suprimir la formación de espuma.
La agitación y aireación se pueden realizar suavemente.
Se han adoptado muchos enfoques para reducir el crecimiento de las paredes [20] [21]
Varias aplicaciones utilizan paletas, burbujeo u otros mecanismos para mezclar [22]
El goteo se puede hacer menos drástico con gotas más pequeñas y volúmenes de recipiente más grandes.
Muchas mejoras apuntan a la amenaza de contaminación.
Consideraciones de diseño experimental
Elección y configuración de parámetros.
[23]
La concentración en estado estacionario del sustrato limitante en el quimiostato es independiente de la concentración de afluencia. La concentración de afluencia afectará la concentración celular y, por tanto, la DO en estado estacionario.
Aunque la concentración límite de sustrato en el quimiostato suele ser muy baja y se mantiene mediante pulsos de entrada discretos altamente concentrados, en la práctica la variación temporal en la concentración dentro del quimiostato es pequeña (un pequeño porcentaje o menos) y, por lo tanto, puede considerarse como estado casi estacionario.
El tiempo que tarda la densidad celular (OD) en converger a un valor de estado estacionario (exceso/insuficiencia) suele ser largo (múltiples cambios de quimiostato), especialmente cuando el inóculo inicial es grande. Sin embargo, el tiempo se puede minimizar con la elección adecuada de los parámetros.
Crecimiento en estado estacionario
[23]
Puede parecer que un quimiostato está en estado estacionario, pero la adquisición de cepas mutantes puede ocurrir continuamente, aunque no sean detectables mediante el monitoreo de parámetros de macroescala como la DO o las concentraciones del producto.
El sustrato limitante suele estar en concentraciones tan bajas que es indetectable. Como resultado, la concentración del sustrato limitante puede variar mucho con el tiempo (en porcentaje) a medida que diferentes cepas se apoderan de la población, incluso si los cambios resultantes en la DO son demasiado pequeños para detectarlos.
Un quimiostato "pulsado" (con pulsos de afluencia muy grandes) tiene una capacidad selectiva sustancialmente menor que un quimiostato casi continuo estándar, para una cepa mutante con mayor aptitud en condiciones limitantes.
Al reducir abruptamente la concentración de sustrato limitante de la entrada, es posible someter temporalmente a las células a condiciones relativamente más duras, hasta que el quimiostato se estabilice nuevamente al estado estacionario (en el orden temporal de la tasa de dilución D).
Mutación
[23]
Algunos tipos de cepas mutantes aparecerán rápidamente:
Si hay un SNP que puede aumentar la aptitud, debería aparecer en la población después de sólo unas pocas duplicaciones de quimiostatos, para quimiostatos característicamente grandes (por ejemplo, 10^11 células de E. coli ).
Una cepa que requiere dos SNP específicos donde sólo su combinación proporciona una ventaja de aptitud (mientras que cada uno por separado es neutral), es probable que aparezca sólo si el tamaño objetivo (el número de ubicaciones diferentes de SNP que dan lugar a una mutación ventajosa) para cada uno El SNP es muy grande.
Es muy poco probable que aparezcan otros tipos de cepas mutantes (por ejemplo, dos SNP con un tamaño objetivo pequeño, más SNP o en quimiostatos más pequeños).
Estas otras mutaciones sólo se esperan mediante barridos sucesivos de mutantes con una ventaja de aptitud física. Sólo se puede esperar que surjan múltiples mutantes si cada mutación es beneficiosa de forma independiente, y no en los casos en que las mutaciones sean neutrales individualmente pero ventajosas en conjunto. Las adquisiciones sucesivas son la única manera confiable de que la evolución avance en un quimiostato.
El escenario aparentemente extremo en el que requerimos que todos los SNP posibles coexistan al menos una vez en el quimiostato es en realidad bastante probable. Es muy probable que un quimiostato grande alcance este estado.
Para un quimiostato grande, el tiempo esperado hasta que se produzca una mutación ventajosa es del orden del tiempo de renovación del quimiostato. Tenga en cuenta que esto suele ser sustancialmente más corto que el tiempo que tarda una cepa ventajosa en apoderarse de la población de quimiostatos. Esto no es necesariamente así en un quimiostato pequeño.
Se espera que los puntos anteriores sean los mismos en diferentes especies de reproducción asexual ( E. coli , S. cerevisiae , etc.).
Además, el tiempo hasta la aparición de la mutación es independiente del tamaño del genoma, pero depende de la tasa de mutación por BP.
Para quimiostatos característicamente grandes, una cepa hipermutante no ofrece una ventaja suficiente para justificar su uso. Además, no tiene suficiente ventaja selectiva como para esperar que aparezca siempre a través de una mutación aleatoria y se apodere del quimiostato.
adquisición única
[23]
El tiempo de toma de control es predecible teniendo en cuenta los parámetros de deformación relevantes.
Diferentes tasas de dilución favorecen selectivamente que diferentes cepas mutantes se apoderen de la población de quimiostatos, si dicha cepa existe. Por ejemplo:
Una tasa de dilución rápida crea una presión de selección para una cepa mutante con una tasa de crecimiento máxima elevada;
Una tasa de dilución de rango medio crea una presión de selección para una cepa mutante con una mayor afinidad por el sustrato limitante;
Una tasa de dilución lenta crea una presión de selección para una cepa mutante que puede crecer en medios sin sustrato limitante (presumiblemente consumiendo un sustrato diferente presente en los medios);
El tiempo para tomar el control de un mutante superior será bastante constante en una variedad de parámetros operativos. Para valores de operación característicos, el tiempo de toma de control es del orden de días a semanas.
Adquisiciones sucesivas
[23]
Cuando las condiciones son adecuadas (una población lo suficientemente grande y múltiples objetivos en el genoma para mutaciones simples y ventajosas), se espera que múltiples cepas se apoderen sucesivamente de la población, y que lo hagan de una manera relativamente sincronizada y a un ritmo. El momento depende del tipo de mutaciones.
En una sucesión de adquisiciones, incluso si la mejora selectiva de cada una de las cepas se mantiene constante (por ejemplo, cada nueva cepa es mejor que la anterior en un factor constante), la tasa de adquisición no permanece constante, sino que disminuye de una cepa a otra.
Hay casos en los que las adquisiciones sucesivas se producen tan rápidamente que es muy difícil diferenciar entre cepas, incluso cuando se examina la frecuencia de los alelos. Por lo tanto, un linaje de múltiples adquisiciones de cepas consecutivas podría aparecer como la adquisición de una única cepa con una cohorte de mutaciones.
Variaciones
Las configuraciones de fermentación estrechamente relacionadas con los quimiostatos son el turbidostato , el auxostato y el retentostato. En los retentostatos, el líquido de cultivo también se retira del biorreactor, pero un filtro retiene la biomasa. En este caso, la concentración de biomasa aumenta hasta que el requerimiento de nutrientes para el mantenimiento de la biomasa sea igual a la cantidad de nutriente limitante que se puede consumir.
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