Abrazadera de voltaje

La pinza de tensión funciona mediante retroalimentación negativa . El amplificador de potencial de membrana mide el voltaje de la membrana y envía la salida al amplificador de retroalimentación; esto resta el voltaje de la membrana del voltaje de comando, que recibe del generador de señales. Esta señal se amplifica y la salida se envía al axón a través del electrodo de paso de corriente .

La pinza de voltaje es un método experimental utilizado por los electrofisiólogos para medir las corrientes iónicas a través de las membranas de células excitables, como las neuronas , mientras se mantiene el voltaje de la membrana en un nivel establecido. ^[1] Una pinza de voltaje básica medirá iterativamente el potencial de membrana y luego cambiará el potencial de membrana (voltaje) a un valor deseado agregando la corriente necesaria. Esto "sujeta" la membrana celular a un voltaje constante deseado, lo que permite que la pinza de voltaje registre qué corrientes se entregan. Debido a que las corrientes aplicadas a la celda deben ser iguales (y de carga opuesta ) a la corriente que atraviesa la membrana celular al voltaje establecido, las corrientes registradas indican cómo reacciona la celda a los cambios en el potencial de membrana. ^[2] Las membranas celulares de las células excitables contienen muchos tipos diferentes de canales iónicos , algunos de los cuales están dependientes de voltaje . La abrazadera de voltaje permite manipular el voltaje de la membrana independientemente de las corrientes iónicas, lo que permite estudiar las relaciones corriente-voltaje de los canales de la membrana. ^[3]

Historia

El concepto de pinza de voltaje se atribuye a Kenneth Cole ^[4] y George Marmont ^[5] en la primavera de 1947. ^[6] Insertaron un electrodo interno en el axón gigante de un calamar y comenzaron a aplicar una corriente. Cole descubrió que era posible utilizar dos electrodos y un circuito de retroalimentación para mantener el potencial de membrana de la célula en un nivel establecido por el experimentador.

Cole desarrolló la técnica de fijación de voltaje antes de la era de los microelectrodos , por lo que sus dos electrodos consistían en finos cables trenzados alrededor de una varilla aislante . Debido a que este tipo de electrodo sólo podía insertarse en las células más grandes, los primeros experimentos electrofisiológicos se realizaron casi exclusivamente en axones de calamar .

Una fotografía personal de Kenneth Cole, entregada al Dr. J. Walter Woodbury.

Los calamares lanzan chorros de agua cuando necesitan moverse rápidamente, como cuando escapan de un depredador. Para que este escape sea lo más rápido posible, cuentan con un axón que puede alcanzar 1 mm de diámetro (las señales se propagan más rápidamente por los axones grandes). El axón gigante del calamar fue la primera preparación que pudo usarse para bloquear el voltaje de una corriente transmembrana, y fue la base de los experimentos pioneros de Hodgkin y Huxley sobre las propiedades del potencial de acción. ^[6]

Alan Hodgkin se dio cuenta de que, para comprender el flujo de iones a través de la membrana, era necesario eliminar las diferencias en el potencial de membrana. ^[7] Utilizando experimentos con la pinza de voltaje, Hodgkin y Andrew Huxley publicaron cinco artículos en el verano de 1952 describiendo cómo las corrientes iónicas dan lugar al potencial de acción . ^[8] El artículo final propuso el modelo de Hodgkin-Huxley que describe matemáticamente el potencial de acción. El uso de pinzas de tensión en sus experimentos para estudiar y modelar en detalle el potencial de acción ha sentado las bases de la electrofisiología ; por lo que compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1963 . ^[7]

Técnica

La pinza de tensión es un generador de corriente. El voltaje transmembrana se registra a través de un "electrodo de voltaje", en relación con tierra , y un "electrodo de corriente" pasa corriente a la celda. El experimentador establece un "voltaje de mantenimiento" o "potencial de comando", y la pinza de voltaje utiliza retroalimentación negativa para mantener la celda en este voltaje. Los electrodos están conectados a un amplificador, que mide el potencial de membrana y envía la señal a un amplificador de retroalimentación . Este amplificador también recibe una entrada del generador de señales que determina el potencial de comando, resta el potencial de membrana del potencial de comando ( _comando V - V _m ), magnifica cualquier diferencia y envía una salida al electrodo de corriente. Siempre que la celda se desvía del voltaje de mantenimiento, el amplificador operacional genera una "señal de error", es decir, la diferencia entre el potencial de comando y el voltaje real de la celda. El circuito de retroalimentación pasa corriente a la celda para reducir la señal de error a cero. Así, el circuito de pinza produce una corriente igual y opuesta a la corriente iónica.

Variaciones de la técnica de fijación de voltaje.

Pinza de tensión de dos electrodos mediante microelectrodos.

Pinza de tensión de dos electrodos

La técnica de fijación de voltaje de dos electrodos (TEVC) se utiliza para estudiar las propiedades de las proteínas de membrana, especialmente los canales iónicos. ^[9] Los investigadores utilizan este método más comúnmente para investigar las estructuras de membrana expresadas en los ovocitos de Xenopus . El gran tamaño de estos ovocitos permite un fácil manejo y manipulabilidad. ^[10]

El método TEVC utiliza dos pipetas de baja resistencia, una que detecta voltaje y la otra que inyecta corriente. Los microelectrodos se llenan con una solución conductora y se insertan en la célula para controlar artificialmente el potencial de membrana. La membrana actúa como dieléctrico y como resistencia , mientras que los fluidos a ambos lados de la membrana funcionan como condensadores . ^[10] Los microelectrodos comparan el potencial de la membrana con un voltaje de comando, brindando una reproducción precisa de las corrientes que fluyen a través de la membrana. Las lecturas actuales se pueden utilizar para analizar la respuesta eléctrica de la celda a diferentes aplicaciones.

Esta técnica se prefiere a la abrazadera de un solo microelectrodo u otras técnicas de abrazadera de voltaje cuando las condiciones requieren resolver grandes corrientes. La alta capacidad de paso de corriente de la pinza de dos electrodos permite fijar grandes corrientes que son imposibles de controlar con técnicas de parche de un solo electrodo . ^[11] El sistema de dos electrodos también es deseable por su rápido tiempo de ajuste de la abrazadera y su bajo ruido. Sin embargo, el uso de TEVC tiene un uso limitado con respecto al tamaño de la celda. Es eficaz en ovocitos de mayor diámetro, pero más difícil de utilizar con células pequeñas. Además, el método TEVC está limitado porque el transmisor de corriente debe estar contenido en la pipeta. No es posible manipular el líquido intracelular durante el pinzamiento, lo cual es posible utilizando técnicas de pinzamiento con parche. ^[2] Otra desventaja tiene que ver con los problemas de "abrazadera de espacio". La pinza de voltaje de Cole utilizó un cable largo que sujetaba el axón del calamar uniformemente en toda su longitud. Los microelectrodos TEVC pueden proporcionar solo una fuente puntual espacial de corriente que puede no afectar uniformemente a todas las partes de una celda de forma irregular.

Pinza de voltaje de doble celda

La técnica de abrazadera de voltaje de celda dual es una variación especializada de la abrazadera de voltaje de dos electrodos y solo se utiliza en el estudio de canales de unión entre espacios . ^[12] Las uniones hendidas son poros que unen directamente dos células a través de las cuales los iones y las moléculas pequeñas fluyen libremente. Cuando dos células en las que se expresan proteínas de unión gap, típicamente conexinas o innexinas , ya sea de forma endógena o mediante inyección de ARNm , se formará un canal de unión entre las células. Como hay dos celdas presentes en el sistema, se utilizan dos juegos de electrodos. Se insertan un electrodo de registro y un electrodo de inyección de corriente en cada celda, y cada celda se sujeta individualmente (cada conjunto de electrodos se conecta a un aparato separado y la integración de los datos se realiza por computadora). Para registrar la conductancia de unión , la corriente se varía en la primera celda mientras que el electrodo de registro en la segunda celda registra cualquier cambio en V _m solo para la segunda celda. (El proceso se puede revertir con el estímulo ocurriendo en la segunda celda y el registro en la primera celda). Dado que el electrodo en la celda registrada no induce ninguna variación en la corriente, cualquier cambio en el voltaje debe ser inducido por el cruce de corriente hacia la celda registrada, a través de los canales de unión gap, desde la celda en la que se varió la corriente. ^[12]

Pinza de voltaje de un solo electrodo

Esta categoría describe un conjunto de técnicas en las que se utiliza un electrodo para fijar el voltaje. La técnica de pinzamiento continuo de un solo electrodo (SEVC-c) se utiliza a menudo con el registro de parche. La técnica de fijación de voltaje de electrodo único discontinuo (SEVC-d) se utiliza con registro intracelular penetrante. Este único electrodo realiza las funciones tanto de inyección de corriente como de registro de tensión.

Pinza continua monoelectrodo (SEVC-c)

La técnica "patch-clamp" permite el estudio de canales iónicos individuales. Utiliza un electrodo con una punta relativamente grande (> 1 micrómetro) que tiene una superficie lisa (en lugar de una punta afilada). Se trata de un "electrodo de parche" (a diferencia del "electrodo afilado" que se utiliza para empalar células). Este electrodo se presiona contra una membrana celular y se aplica succión para tirar de la membrana celular hacia el interior de la punta del electrodo. La succión hace que la celda forme un sello hermético con el electrodo (un "sello de gigaohmios", ya que la resistencia es superior a un gigaohmios ).

SEV-c tiene la ventaja de que puede grabar desde células pequeñas que serían imposibles de atravesar con dos electrodos. Sin embargo:

1. Los microelectrodos son conductores imperfectos; por lo general, tienen una resistencia de más de un millón de ohmios . Rectifican (es decir, cambian su resistencia con el voltaje, a menudo de manera irregular), a veces tienen una resistencia inestable si se obstruyen por el contenido de la celda. Por lo tanto, no registrarán fielmente el voltaje de la celda, especialmente cuando cambia rápidamente, ni transmitirán corriente fielmente.
2. Errores de voltaje y corriente: el circuito SEV-c en realidad no mide el voltaje de la celda que se está sujetando (como lo hace una abrazadera de dos electrodos). El amplificador de abrazadera de conexión es como una abrazadera de dos electrodos, excepto que los circuitos de medición de voltaje y de paso de corriente están conectados (en la abrazadera de dos electrodos, están conectados a través de la celda ). El electrodo está conectado a un cable que hace contacto con el bucle de corriente/voltaje dentro del amplificador. Por tanto, el electrodo sólo tiene una influencia indirecta sobre el circuito de realimentación. El amplificador lee solo el voltaje en la parte superior del electrodo y devuelve corriente para compensar. Pero, si el electrodo es un conductor imperfecto, el circuito de pinza sólo tiene una visión distorsionada del potencial de membrana. Del mismo modo, cuando el circuito devuelve corriente para compensar ese voltaje (distorsionado), el electrodo distorsionará la corriente antes de que llegue a la celda. Para compensar esto, el electrofisiólogo utiliza el electrodo de menor resistencia posible, se asegura de que las características del electrodo no cambien durante un experimento (por lo que los errores serán constantes) y evita registrar corrientes con una cinética que probablemente sea demasiado rápida para que la pinza pueda captarla. seguir con precisión. La precisión de SEV-c aumenta cuanto más lentos y pequeños son los cambios de voltaje que intenta frenar.
3. Errores de resistencia en serie: las corrientes que pasan a la celda deben ir a tierra para completar el circuito. El amplificador registra los voltajes en relación con tierra. Cuando una célula se mantiene en su potencial de reposo natural , no hay problema; la pinza no pasa corriente y el voltaje lo genera únicamente la celda. Pero, cuando se fija a un potencial diferente, los errores de resistencia en serie se convierten en una preocupación; la célula pasará corriente a través de su membrana en un intento de volver a su potencial de reposo natural. El amplificador de pinza se opone a esto pasando corriente para mantener el potencial de retención. Surge un problema porque el electrodo está entre el amplificador y la celda; es decir, el electrodo está en serie con la resistencia que es la membrana de la celda. Por lo tanto, al pasar corriente a través del electrodo y la celda, la ley de Ohm nos dice que esto causará que se forme un voltaje a través de la resistencia de la celda y del electrodo. Como estas resistencias están en serie, las caídas de voltaje se sumarán. Si el electrodo y la membrana celular tienen resistencias iguales (lo que generalmente no es así), y si el experimentador ordena un cambio de 40 mV desde el potencial de reposo, el amplificador pasará suficiente corriente hasta que lea que ha logrado ese cambio de 40 mV. Sin embargo, en este ejemplo, la mitad de esa caída de voltaje ocurre a través del electrodo. El experimentador cree que ha movido el voltaje de la celda en 40 mV, pero lo ha movido sólo en 20 mV. La diferencia es el "error de resistencia en serie". Los amplificadores de abrazadera de conexión modernos tienen circuitos para compensar este error, pero estos compensan sólo el 70-80% del mismo. El electrofisiólogo puede reducir aún más el error registrando en o cerca del potencial de reposo natural de la célula y utilizando un electrodo de resistencia lo más baja posible.
4. Errores de capacitancia. Los microelectrodos son condensadores y son particularmente problemáticos porque no son lineales. La capacitancia surge porque el electrolito dentro del electrodo está separado por un aislante (vidrio) de la solución exterior. Este es, por definición y función, un condensador. Peor aún, a medida que el grosor del vidrio cambia cuanto más se aleja de la punta, la constante de tiempo del condensador variará. Esto produce un registro distorsionado del voltaje o la corriente de la membrana cada vez que cambian. Los amplificadores pueden compensar esto, pero no del todo porque la capacitancia tiene muchas constantes de tiempo. El experimentador puede reducir el problema manteniendo la solución de baño de la celda a poca profundidad (exponiendo menos superficie de vidrio al líquido) y recubriendo el electrodo con silicona, resina, pintura u otra sustancia que aumente la distancia entre las soluciones interior y exterior.
5. Errores de sujeción espacial. Un solo electrodo es una fuente puntual de corriente. En partes distantes de la celda, la corriente que pasa a través del electrodo tendrá menos influencia que en partes cercanas de la celda. Esto es particularmente un problema cuando se graban desde neuronas con estructuras dendríticas elaboradas. No se puede hacer nada con respecto a los errores de fijación espacial excepto moderar las conclusiones del experimento.

Pinza de tensión discontinua de un solo electrodo (SEVC-d)

Una pinza de voltaje de un solo electrodo, discontinua o SEVC-d, tiene algunas ventajas sobre SEVC-c para el registro de células completas. En esto, se adopta un enfoque diferente para pasar corriente y registrar voltaje. Un amplificador SEVC-d funciona en régimen de " tiempo compartido ", por lo que el electrodo cambia de forma regular y frecuente entre corriente de paso y tensión de medición. En efecto, hay dos electrodos, pero cada uno está en funcionamiento sólo la mitad del tiempo que está encendido. La oscilación entre las dos funciones de un solo electrodo se denomina ciclo de trabajo. Durante cada ciclo, el amplificador mide el potencial de membrana y lo compara con el potencial de retención. Un amplificador operacional mide la diferencia y genera una señal de error. Esta corriente es una imagen especular de la corriente generada por la celda. Las salidas del amplificador cuentan con circuitos de muestreo y retención , por lo que cada voltaje muestreado brevemente se mantiene en la salida hasta la siguiente medición en el siguiente ciclo. Para ser específico, el amplificador mide el voltaje en los primeros microsegundos del ciclo, genera la señal de error y pasa el resto del ciclo pasando corriente para reducir ese error. Al comienzo del siguiente ciclo, se mide nuevamente el voltaje, se genera una nueva señal de error, pasa corriente, etc. El experimentador establece la duración del ciclo y es posible tomar muestras con períodos tan bajos como aproximadamente 15 microsegundos, correspondientes a 67 kHz. frecuencia de cambio. Las frecuencias de conmutación inferiores a aproximadamente 10 kHz no son suficientes cuando se trabaja con potenciales de acción de menos de 1 milisegundo de ancho. Tenga en cuenta que no todos los amplificadores de pinza de tensión discontinuos admiten frecuencias de conmutación superiores a 10 kHz. ^[10]

Para que esto funcione, la capacitancia de la celda debe ser mayor que la capacitancia del electrodo en al menos un orden de magnitud . La capacitancia ralentiza la cinética (los tiempos de subida y bajada) de las corrientes. Si la capacitancia del electrodo es mucho menor que la de la celda, cuando la corriente pasa a través del electrodo, el voltaje del electrodo cambiará más rápido que el voltaje de la celda. Por lo tanto, cuando se inyecta corriente y luego se apaga (al final de un ciclo de trabajo), el voltaje del electrodo disminuirá más rápido que el voltaje de la celda. Tan pronto como el voltaje del electrodo es asíntoto al voltaje de la celda, se puede muestrear el voltaje (nuevamente) y aplicar la siguiente cantidad de carga. Por tanto, la frecuencia del ciclo de trabajo está limitada a la velocidad a la que el voltaje del electrodo aumenta y disminuye mientras pasa la corriente. Cuanto menor sea la capacitancia del electrodo, más rápido se podrá realizar el ciclo.

SEVC-d tiene una gran ventaja sobre SEVC-c al permitir al experimentador medir el potencial de membrana y, como evita el paso de corriente y la medición de voltaje al mismo tiempo, nunca hay un error de resistencia en serie. Las principales desventajas son que la resolución temporal es limitada y el amplificador es inestable. Si pasa demasiada corriente, de modo que se sobrepasa el voltaje objetivo, invierte la polaridad de la corriente en el siguiente ciclo de trabajo. Esto hace que no alcance el voltaje objetivo, por lo que el siguiente ciclo invierte nuevamente la polaridad de la corriente inyectada. Este error puede crecer con cada ciclo hasta que el amplificador oscile fuera de control (“timbre”); Esto suele provocar la destrucción de la célula que se está grabando. El investigador quiere un ciclo de trabajo corto para mejorar la resolución temporal; El amplificador tiene compensadores ajustables que harán que el voltaje del electrodo decaiga más rápido, pero si se configuran demasiado alto, el amplificador sonará, por lo que el investigador siempre está tratando de "sintonizar" el amplificador lo más cerca posible del borde de la oscilación incontrolada. en cuyo caso pequeños cambios en las condiciones de grabación pueden provocar un timbre. Hay dos soluciones: “retroceder” la configuración del amplificador a un rango seguro o estar alerta a las señales de que el amplificador está a punto de sonar.

Modelo matematico

Desde el punto de vista de la teoría del control , el experimento de fijación de voltaje puede describirse en términos de la aplicación de una ley de control de retroalimentación de salida de alta ganancia ^[13] a la membrana neuronal. ^[14] Matemáticamente, el voltaje de la membrana se puede modelar mediante un modelo basado en conductancia con una entrada dada por la corriente aplicada y una salida dada por el voltaje de la membrana . El modelo original basado en la conductancia de Hodgkin y Huxley, que representa una membrana neuronal que contiene corrientes de iones de sodio y potasio , así como una corriente de fuga , viene dado por el sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias. ${\displaystyle I_{app}(t)}$ ${\displaystyle V(t)}$

${\displaystyle C_{m}{\frac {dV}{dt}}=-{\bar {g}}_{\text{K}}n^{4}(V-V_{\text{K}})-{\bar {g}}_{\text{Na}}m^{3}h(V-V_{\text{Na}})-{\bar {g}}_{\text{L}}(V-V_{L})+I_{app}}$

${\displaystyle {\frac {dp}{dt}}=\alpha _{p}(V)(1-p)-\beta _{p}(V)p,\quad p=m,n,h}$

donde es la capacitancia de la membrana, y son conductancias máximas, y son potenciales de inversión, y son constantes de velocidad dependientes del voltaje del canal iónico, y las variables de estado , y son variables de activación del canal iónico . ${\displaystyle C_{m}}$ ${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{Na}}}$ ${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{K}}}$ ${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{L}}}$ ${\displaystyle V_{\text{Na}}}$ ${\displaystyle V_{\text{K}}}$ ${\displaystyle V_{\text{L}}}$ ${\displaystyle \alpha _{p}}$ ${\displaystyle \beta _{p}}$ ${\displaystyle m}$ ${\displaystyle h}$ ${\displaystyle n}$

Es posible demostrar rigurosamente que la ley de retroalimentación

${\displaystyle I_{app}(t)=k(V_{\text{ref}}-V(t))}$

impulsa el voltaje de la membrana arbitrariamente cerca del voltaje de referencia a medida que la ganancia aumenta a un valor arbitrariamente grande. ^[14] Este hecho, que de ninguna manera es una propiedad general de los sistemas dinámicos (una alta ganancia puede, en general, conducir a inestabilidad ^[15] ), es una consecuencia de la estructura y las propiedades del modelo basado en la conductancia. arriba. En particular, la dinámica de cada variable de activación , que es impulsada por , verifica la fuerte propiedad de estabilidad de la contracción exponencial. ^{[14] [16]} ${\displaystyle V(t)}$ ${\displaystyle V_{\text{ref}}}$ ${\displaystyle k>0}$ ${\displaystyle p=m,h,n}$ ${\displaystyle V}$

Referencias

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2. Hernández-Ochoa EO, Schneider MF (abril de 2012). "Métodos de fijación de voltaje para el estudio de las corrientes de membrana y la liberación de SR Ca (2+) en fibras de músculo esquelético adulto". Avances en Biofísica y Biología Molecular . 108 (3): 98-118. doi :10.1016/j.pbiomolbio.2012.01.001. PMC 3321118 . PMID  22306655. 
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Otras lecturas

• Sherman-Gold R, ed. (1993). «Bioelectricidad» (PDF) . La guía Axon para técnicas de laboratorio de electrofisiología y biofísica . Instrumentos Axon. págs. 1–16. OCLC  248830666.