Luciferasa es un término genérico para la clase de enzimas oxidativas que producen bioluminiscencia , y generalmente se distingue de una fotoproteína . El nombre fue utilizado por primera vez por Raphaël Dubois , quien inventó las palabras luciferina y luciferasa , para el sustrato y la enzima , respectivamente. [1] Ambas palabras se derivan de la palabra latina lucifer , que significa "portador de luz", que a su vez se deriva de las palabras latinas para "luz" ( lux) y "traer o llevar" ( ferre) . [2]
Las luciferasas se utilizan ampliamente en biotecnología , para la obtención de imágenes de bioluminiscencia [3], la microscopía y como genes reporteros , para muchas de las mismas aplicaciones que las proteínas fluorescentes . Sin embargo, a diferencia de las proteínas fluorescentes, las luciferasas no requieren una fuente de luz externa , pero sí requieren la adición de luciferina , el sustrato consumible.
Una variedad de organismos regulan su producción de luz utilizando diferentes luciferasas en una variedad de reacciones de emisión de luz. La mayoría de las luciferasas estudiadas se han encontrado en animales, incluidas las luciérnagas [4] y muchos animales marinos como los copépodos , las medusas y el pensamiento marino . Sin embargo, las luciferasas se han estudiado en hongos luminosos, como el hongo Jack-O-Lantern , así como ejemplos en otros reinos, incluidas las bacterias bioluminiscentes y los dinoflagelados .
Las luciferasas de las luciérnagas (de las que hay más de 2000 especies ) y de los demás elateroideos (escarabajos chasqueadores y parientes en general) son lo suficientemente diversas como para ser útiles en la filogenia molecular . [5] En las luciérnagas, el oxígeno necesario se suministra a través de un tubo en el abdomen llamado tráquea abdominal . Una luciferasa bien estudiada es la de la luciérnaga Photinini (Photinus pyralis) , que tiene un pH óptimo de 7,8. [6]
También se ha estudiado en profundidad el pensamiento marino , Renilla reniformis . En este organismo, la luciferasa ( Renilla-luciferina 2-monooxigenasa ) está estrechamente asociada a una proteína de unión a la luciferina, así como a una proteína fluorescente verde ( GFP ). El calcio desencadena la liberación de la luciferina ( coelenterazina ) de la proteína de unión a la luciferina. El sustrato queda entonces disponible para la oxidación por parte de la luciferasa, donde se degrada a coelenteramida con la consiguiente liberación de energía. En ausencia de GFP, esta energía se liberaría como un fotón de luz azul (longitud de onda de emisión máxima de 482 nm). Sin embargo, debido a la GFP estrechamente asociada, la energía liberada por la luciferasa se acopla en cambio a través de la transferencia de energía de resonancia al fluoróforo de la GFP, y posteriormente se libera como un fotón de luz verde (longitud de onda de emisión máxima de 510 nm). La reacción catalizada es: [7]
Recientemente se han identificado luciferasas más nuevas que, a diferencia de otras luciferasas, son moléculas secretadas de forma natural. Un ejemplo de ello es la luciferasa dependiente de coelenterazina de Metridia (MetLuc, A0A1L6CBM1 ) que se deriva del copépodo marino Metridia longa . El gen de la luciferasa secretada por Metridia longa codifica una proteína de 24 kDa que contiene un péptido señal secretor N-terminal de 17 residuos de aminoácidos . La sensibilidad y la alta intensidad de la señal de esta molécula de luciferasa resultan ventajosas en muchos estudios de reporteros. Algunos de los beneficios de utilizar una molécula reportera secretada como MetLuc es su protocolo sin lisis que permite realizar ensayos de células vivas y múltiples ensayos en la misma célula. [8]
La bioluminiscencia bacteriana se observa en especies de Photobacterium, Vibrio fischeri , Vibrio haweyi y Vibrio harveyi . La emisión de luz en algunas bacterias bioluminiscentes utiliza una "antena", como la proteína lumazina, para aceptar la energía del estado excitado primario de la luciferasa, lo que da como resultado un cromóforo lulnazina excitado que emite luz de una longitud de onda más corta (más azul), mientras que en otras se utiliza una proteína fluorescente amarilla (YFP) con mononucleótido de flavina (FMN) como cromóforo y emite luz que se desplaza hacia el rojo en relación con la de la luciferasa. [9]
La luciferasa dinoflagelada es una proteína eucariota multidominio , que consta de un dominio N-terminal y tres dominios catalíticos , cada uno de los cuales precedido por un dominio de haz helicoidal. Se ha resuelto la estructura del dominio catalítico de la luciferasa dinoflagelada. [10] La parte central del dominio es un barril beta de 10 hebras que es estructuralmente similar a las lipocalinas y FABP . [10] El dominio N-terminal se conserva entre la luciferasa dinoflagelada y las proteínas de unión a luciferina (LBP). Se ha sugerido que esta región puede mediar una interacción entre LBP y luciferasa o su asociación con la membrana vacuolar . [11] El dominio de haz helicoidal tiene una estructura de haz de tres hélices que contiene cuatro histidinas importantes que se cree que desempeñan un papel en la regulación del pH de la enzima . [10] Hay un bolsillo grande en el barril β de la luciferasa de dinoflagelado a pH 8 para acomodar el sustrato tetrapirrol pero no hay abertura para permitir que el sustrato entre. Por lo tanto, debe ocurrir un cambio conformacional significativo para proporcionar acceso y espacio para un ligando en el sitio activo y la fuente de este cambio es a través de los cuatro residuos de histidina N-terminales. [10] A pH 8, se puede ver que los residuos de histidina no protonados están involucrados en una red de enlaces de hidrógeno en la interfaz de las hélices en el haz que bloquean el acceso del sustrato al sitio activo y la interrupción de esta interacción por protonación (a pH 6,3) o por reemplazo de los residuos de histidina por alanina provoca un gran movimiento molecular del haz, separando las hélices por 11Å y abriendo el sitio catalítico. [10] Lógicamente, los residuos de histidina no pueden ser reemplazados por alanina en la naturaleza, pero este reemplazo experimental confirma además que los residuos de histidina más grandes bloquean el sitio activo. Además, tres secuencias Gly-Gly, una en la hélice N-terminal y dos en el motivo hélice-bucle-hélice, podrían servir como bisagras alrededor de las cuales giran las cadenas para abrir aún más la vía hacia el sitio catalítico y agrandar el sitio activo. [10]
Una luciferasa de dinoflagelado es capaz de emitir luz debido a su interacción con su sustrato ( luciferina ) y la proteína de unión a luciferina (LBP) en el orgánulo scintillon encontrado en dinoflagelados. [10] La luciferasa actúa de acuerdo con la luciferina y LBP para emitir luz, pero cada componente funciona a un pH diferente. La luciferasa y sus dominios no son activos a pH 8, pero son extremadamente activos al pH óptimo de 6,3, mientras que LBP se une a la luciferina a pH 8 y la libera a pH 6,3. [10] En consecuencia, la luciferina solo se libera para reaccionar con una luciferasa activa cuando el scintillon se acidifica a pH 6,3. Por lo tanto, para reducir el pH, se abren canales controlados por voltaje en la membrana del scintillon para permitir la entrada de protones desde una vacuola que posee un potencial de acción producido a partir de una estimulación mecánica. [10] Por lo tanto, se puede observar que el potencial de acción en la membrana vacuolar conduce a la acidificación y esto a su vez permite que la luciferina se libere para reaccionar con la luciferasa en el centelleo, produciendo un destello de luz azul.
Todas las luciferasas se clasifican como oxidorreductasas ( EC 1.13.12.-), lo que significa que actúan sobre donantes únicos con incorporación de oxígeno molecular. Debido a que las luciferasas pertenecen a muchas familias de proteínas diversas que no están relacionadas, no existe un mecanismo unificador, ya que cualquier mecanismo depende de la combinación de luciferasa y luciferina. Sin embargo, se ha demostrado que todas las reacciones luciferasa-luciferina caracterizadas hasta la fecha requieren oxígeno molecular en alguna etapa.
La reacción catalizada por la luciferasa bacteriana también es un proceso oxidativo:
En la reacción, el oxígeno molecular oxida el mononucleótido de flavina y un aldehído alifático de cadena larga a un ácido carboxílico alifático . La reacción forma un intermedio de hidroxiflavina excitado, que se deshidrata al producto FMN para emitir luz azul verdosa. [12]
Casi toda la energía que entra en la reacción se transforma en luz. La reacción tiene una eficiencia del 80% [13] al 90% [14] . En comparación, la bombilla incandescente solo convierte alrededor del 10% de su energía en luz [15] y un LED de 150 lúmenes por vatio (lm/W) convierte el 20% de la energía de entrada en luz visible. [14]
Las luciferasas se pueden producir en el laboratorio mediante ingeniería genética para diversos fines. Los genes de la luciferasa se pueden sintetizar e insertar en organismos o transfectar en células. En 2002, los ratones , los gusanos de seda y las patatas eran sólo algunos de los organismos que ya habían sido modificados para producir la proteína. [16]
En la reacción de la luciferasa, se emite luz cuando la luciferasa actúa sobre el sustrato de luciferina apropiado . La emisión de fotones se puede detectar mediante aparatos sensibles a la luz, como un luminómetro o un microscopio óptico con una cámara CCD . Esto permite la observación de procesos biológicos. [17] Dado que no se necesita excitación luminosa para la bioluminiscencia de la luciferasa, hay una autofluorescencia mínima y, por lo tanto, la señal bioluminiscente está prácticamente libre de fondo. [18] Por lo tanto, aún se pueden medir con precisión tan solo 0,02 pg utilizando un contador de centelleo estándar . [19]
En la investigación biológica, la luciferasa se utiliza comúnmente como un indicador para evaluar la actividad transcripcional en células que se transfectan con un constructo genético que contiene el gen de la luciferasa bajo el control de un promotor de interés. [20] Además, las moléculas proluminiscentes que se convierten en luciferina tras la actividad de una enzima particular se pueden utilizar para detectar la actividad enzimática en ensayos de luciferasa acoplados o de dos pasos. Dichos sustratos se han utilizado para detectar la actividad de la caspasa y la actividad del citocromo P450 , entre otras. [17] [20]
La luciferasa también se puede utilizar para detectar el nivel de ATP celular en ensayos de viabilidad celular o para ensayos de actividad de quinasas. [20] [21] La luciferasa puede actuar como una proteína sensora de ATP a través de la biotinilación . La biotinilación inmovilizará la luciferasa en la superficie celular uniéndose a un complejo de estreptavidina - biotina . Esto permite que la luciferasa detecte el eflujo de ATP de la célula y mostrará de manera efectiva la liberación de ATP en tiempo real a través de la bioluminiscencia. [22] Además, la luciferasa se puede hacer más sensible para la detección de ATP aumentando la intensidad de la luminiscencia al cambiar ciertos residuos de aminoácidos en la secuencia de la proteína. [23]
La obtención de imágenes de todo el organismo (denominadas in vivo cuando están intactas o, de otro modo, imágenes ex vivo , por ejemplo, de tejido vivo pero explantado) es una técnica poderosa para estudiar poblaciones celulares en plantas o animales vivos, como ratones. [24] Se pueden diseñar diferentes tipos de células (por ejemplo, células madre de la médula ósea, células T) para que expresen una luciferasa, lo que permite su visualización no invasiva dentro de un animal vivo utilizando una cámara con dispositivo de acoplamiento de carga sensible ( cámara CCD ). Esta técnica se ha utilizado para seguir la tumorigénesis y la respuesta de los tumores al tratamiento en modelos animales. [25] [26] Sin embargo, los factores ambientales y las interferencias terapéuticas pueden causar algunas discrepancias entre la carga tumoral y la intensidad de la bioluminiscencia en relación con los cambios en la actividad proliferativa. La intensidad de la señal medida mediante imágenes in vivo puede depender de varios factores, como la absorción de D -luciferina a través del peritoneo, el flujo sanguíneo, la permeabilidad de la membrana celular, la disponibilidad de cofactores, el pH intracelular y la transparencia del tejido suprayacente, además de la cantidad de luciferasa. [27]
La luciferasa es una proteína sensible al calor que se utiliza en estudios sobre la desnaturalización de proteínas , para probar las capacidades protectoras de las proteínas de choque térmico . Las oportunidades para el uso de la luciferasa siguen aumentando. [28]
Medios relacionados con Luciferasa en Wikimedia Commons