La lisozima ( EC 3.2.1.17, muramidasa, N -acetilmuramida glicanhidrolasa ; nombre sistemático peptidoglicano N -acetilmuramoilhidrolasa ) es una enzima antimicrobiana producida por animales que forma parte del sistema inmunitario innato . Es una glicósido hidrolasa que cataliza el siguiente proceso:
El peptidoglicano es el componente principal de la pared celular bacteriana grampositiva . [1] Esta hidrólisis a su vez compromete la integridad de las paredes celulares bacterianas provocando la lisis de las bacterias.
La lisozima es abundante en secreciones como las lágrimas , la saliva , la leche humana y el moco . También está presente en los gránulos citoplasmáticos de los macrófagos y los neutrófilos polimorfonucleares (PMN). Se pueden encontrar grandes cantidades de lisozima en la clara de huevo . Las lisozimas de tipo C están estrechamente relacionadas con la α-lactoalbúmina en secuencia y estructura, lo que las convierte en parte de la misma familia de glicósido hidrolasas 22 . [2] En los seres humanos, la enzima lisozima de tipo C está codificada por el gen LYZ . [3] [4]
La lisozima de clara de huevo de gallina es térmicamente estable, con un punto de fusión que alcanza hasta 72 °C a un pH de 5,0. [5] Sin embargo, la lisozima de la leche humana pierde actividad muy rápidamente a esa temperatura. [6] La lisozima de clara de huevo de gallina mantiene su actividad en un amplio rango de pH (6-9). [7] Su punto isoeléctrico es 11,35. [8] El punto isoeléctrico de la lisozima de la leche humana es 10,5-11. [9]
La enzima actúa hidrolizando los enlaces glucosídicos en los peptidoglicanos . La enzima también puede romper los enlaces glucosídicos en la quitina , aunque no con tanta eficacia como las quitinasas verdaderas . [10]
El sitio activo de la lisozima se une a la molécula de peptidoglicano en la hendidura prominente entre sus dos dominios. Ataca a los peptidoglicanos (presentes en las paredes celulares de las bacterias, especialmente las bacterias Gram-positivas ), su sustrato natural , entre el ácido N -acetilmurámico (NAM) y el cuarto átomo de carbono de la N-acetilglucosamina (NAG). [ cita requerida ]
También se ha demostrado que los sacáridos más cortos , como el tetrasacárido, son sustratos viables, pero a través de un intermediario con una cadena más larga. [11] También se ha demostrado que la quitina es un sustrato viable para la lisozima. También se han desarrollado y utilizado sustratos artificiales en la lisozima. [12]
El mecanismo de Phillips propuso que el poder catalítico de la enzima provenía tanto de la tensión estérica sobre el sustrato unido como de la estabilización electrostática de un intermediario oxo-carbenio . A partir de los datos cristalográficos de rayos X, Phillips propuso el sitio activo de la enzima, donde se une un hexasacárido. La lisozima distorsiona el cuarto azúcar (en el subsitio D o -1) en el hexasacárido en una conformación de media silla. En este estado estresado, el enlace glucosídico se rompe más fácilmente. [13] Se crea un intermediario iónico que contiene un oxo-carbenio como resultado de la ruptura del enlace glucosídico. [14] Por lo tanto, la distorsión que hace que la molécula de sustrato adopte una conformación tensa similar a la del estado de transición reducirá la barrera energética de la reacción. [15]
En 1978, Arieh Warshel especuló que el intermediario oxocarbonado propuesto se estabilizaba electrostáticamente mediante residuos de aspartato y glutamato en el sitio activo . El argumento de la estabilización electrostática se basaba en una comparación con el agua a granel: la reorientación de los dipolos de agua puede anular la energía estabilizadora de la interacción de carga. En el modelo de Warshel, la enzima actúa como un superdisolvente, que fija la orientación de los pares de iones y proporciona supersolvatación ( muy buena estabilización de los pares de iones), y especialmente reduce la energía cuando dos iones están cerca uno del otro. [16]
El paso determinante de la velocidad (RDS) en este mecanismo está relacionado con la formación del intermediario oxo-carbenio . Hubo algunos resultados contradictorios para indicar el RDS exacto. Al rastrear la formación del producto ( p-nitrofenol ), se descubrió que el RDS puede cambiar con diferentes temperaturas, lo que fue una razón para esos resultados contradictorios. A una temperatura más alta, el RDS es la formación del intermediario de la enzima glicosil y a una temperatura más baja, la descomposición de ese intermediario. [17]
En un debate temprano en 1969, Dahlquist propuso un mecanismo covalente para la lisozima basado en el efecto isotópico cinético , [14] pero durante mucho tiempo el mecanismo iónico fue más aceptado. En 2001, Vocadlo propuso un mecanismo revisado a través de un intermediario covalente pero no iónico. La evidencia del análisis ESI - MS indicó un intermediario covalente. Se utilizó un sustrato 2-fluoro sustituido para reducir la velocidad de reacción y acumular un intermediario para la caracterización. [19] Se ha descubierto que las cadenas laterales de aminoácidos ácido glutámico 35 (Glu35) y aspartato 52 (Asp52) son críticas para la actividad de esta enzima. Glu35 actúa como un donante de protones al enlace glucosídico, escindiendo el enlace CO en el sustrato, mientras que Asp52 actúa como un nucleófilo para generar un intermediario enzimático glucosílico. El Glu35 reacciona con agua para formar un ion hidroxilo, un nucleófilo más fuerte que el agua, que luego ataca al intermediario enzimático glicosilo, para dar el producto de la hidrólisis y dejar la enzima sin cambios. [20] Este tipo de mecanismo covalente para la catálisis enzimática fue propuesto por primera vez por Koshland . [21]
Más recientemente, las simulaciones de dinámica molecular de mecánica cuántica/mecánica molecular (QM/MM) han utilizado el cristal de HEWL y predicen la existencia de un intermediario covalente. [22] La evidencia de las estructuras de rayos X y ESI-MS indica la existencia de intermediario covalente, pero se basa principalmente en el uso de un sustrato mutante o no nativo menos activo. Por lo tanto, la dinámica molecular QM/MM proporciona la capacidad única de investigar directamente el mecanismo de HEWL de tipo salvaje y el sustrato nativo. Los cálculos revelaron que el intermediario covalente del mecanismo covalente es ~30 kcal/mol más estable que el intermediario iónico del mecanismo de Phillips. [22] Estos cálculos demuestran que el intermediario iónico es extremadamente desfavorable energéticamente y los intermediarios covalentes observados a partir de experimentos que utilizan sustratos mutantes o no nativos menos activos brindan información útil sobre el mecanismo de HEWL de tipo salvaje. [ cita requerida ]
Los derivados de imidazol pueden formar un complejo de transferencia de carga con algunos residuos (dentro o fuera del centro activo) para lograr una inhibición competitiva de la lisozima. [23] En bacterias Gram-negativas , el lipopolisacárido actúa como un inhibidor no competitivo mediante una unión altamente favorecida con la lisozima. [24]
A pesar de que se ha supuesto que la actividad muramidasa de la lisozima desempeña el papel clave para sus propiedades antibacterianas, también se ha informado de evidencia de su acción no enzimática. Por ejemplo, el bloqueo de la actividad catalítica de la lisozima por mutación del aminoácido crítico en el sitio activo (52- Asp -> 52- Ser ) no elimina su actividad antimicrobiana. [25] La capacidad similar a la lectina de la lisozima para reconocer el antígeno carbohidrato bacteriano sin actividad lítica se informó para el tetrasacárido relacionado con el lipopolisacárido de Klebsiella pneumoniae . [26] Además, la lisozima interactúa con anticuerpos y receptores de células T. [27]
La lisozima presenta dos conformaciones: un estado activo abierto y un estado inactivo cerrado. La relevancia catalítica se examinó con transistores de efecto de campo (FET) de nanotubos de carbono de pared simple (SWCN), donde una lisozima singular se unió al FET SWCN. [28] El monitoreo electrónico de la lisozima mostró dos conformaciones, un sitio activo abierto y un sitio inactivo cerrado. En su estado activo, la lisozima es capaz de hidrolizar procesivamente su sustrato, rompiendo en promedio 100 enlaces a una velocidad de 15 por segundo. Para unirse a un nuevo sustrato y pasar del estado inactivo cerrado al estado activo abierto se requieren dos cambios de paso de conformación, mientras que la inactivación requiere un paso. [ cita requerida ]
La lisozima convencional de tipo C forma parte de un grupo más amplio de enzimas relacionadas estructural y mecánicamente, denominada superfamilia de las lisozimas . Esta familia reúne a las lisozimas de tipo C GH22 ("pollo") con las familias de la quitinasa vegetal GH19 , la lisozima de tipo G ("ganso") GH23, la lisozima de tipo V ("viral") GH24 y la quitosanasa GH46 . La nomenclatura del tipo de lisozima solo refleja la fuente de la que se aísla originalmente un tipo y no refleja completamente la distribución taxonómica. [29] Por ejemplo, los humanos y muchos otros mamíferos tienen dos genes de lisozima de tipo G, LYG1 y LYG2. [30]
La lisozima es parte del sistema inmunológico innato. Los niveles reducidos de lisozima se han asociado con la displasia broncopulmonar en los recién nacidos. [35] Los lechones alimentados con leche con lisozima humana pueden recuperarse de la enfermedad diarreica causada por E. coli más rápidamente. La concentración de lisozima en la leche humana es de 1.600 a 3.000 veces mayor que la concentración en la leche de ganado. La lisozima humana es más activa que la lisozima de la clara de huevo de gallina. Se desarrolló una línea transgénica de cabras (con un fundador llamado "Artemis") para producir leche con lisozima humana para proteger a los niños de la diarrea si no pueden obtener los beneficios de la lactancia materna humana. [36] [37]
Dado que la lisozima es una forma natural de protección contra patógenos grampositivos como Bacillus y Streptococcus , [38] desempeña un papel importante en la inmunología de los lactantes alimentados con leche materna. [39] Mientras que la piel es una barrera protectora debido a su sequedad y acidez, la conjuntiva (membrana que cubre el ojo) está, en cambio, protegida por enzimas secretadas, principalmente lisozima y defensina . Sin embargo, cuando estas barreras protectoras fallan, se produce conjuntivitis . [ cita requerida ]
En ciertos tipos de cáncer (especialmente la leucemia mielomonocítica), la producción excesiva de lisozima por parte de las células cancerosas puede provocar niveles tóxicos de lisozima en la sangre. Los niveles elevados de lisozima en la sangre pueden provocar insuficiencia renal y niveles bajos de potasio en la sangre, afecciones que pueden mejorar o resolverse con el tratamiento de la neoplasia maligna primaria. [ cita requerida ]
La lisozima sérica es mucho menos específica para el diagnóstico de sarcoidosis que la enzima convertidora de angiotensina sérica; sin embargo, dado que es más sensible, se utiliza como marcador de la actividad de la enfermedad de sarcoidosis y es adecuada para el seguimiento de la enfermedad en casos comprobados. [40]
La primera síntesis química de una proteína lisozima fue realizada por el profesor George W. Kenner y su grupo en la Universidad de Liverpool en Inglaterra. [41] Esto fue finalmente logrado en 2007 por Thomas Durek en el laboratorio de Steve Kent en la Universidad de Chicago, quien creó una molécula de lisozima funcional sintética. [42]
Los cristales de lisozima se han utilizado para cultivar otros materiales funcionales para catálisis y aplicaciones biomédicas. [43] [44] [45] La lisozima es una enzima comúnmente utilizada para lisar bacterias gram positivas. [46] Debido a la función única de la lisozima en la que puede digerir la pared celular y causar un choque osmótico (hacer estallar la célula al cambiar repentinamente la concentración de soluto alrededor de la célula y, por lo tanto, la presión osmótica ), la lisozima se usa comúnmente en el entorno de laboratorio para liberar proteínas del periplasma de la bacteria mientras que la membrana interna permanece sellada como vesículas llamadas esferoplasto . [47] [48]
Por ejemplo, la E. coli puede lisarse utilizando lisozima para liberar el contenido del espacio periplásmico . Es especialmente útil en el laboratorio para intentar recolectar el contenido del periplasma. [1] El tratamiento con lisozima es óptimo a temperaturas, rangos de pH y concentraciones de sal particulares. La actividad de la lisozima aumenta con el aumento de las temperaturas, hasta 60 grados Celsius, con un rango de pH de 6,0 a 7,0. Las sales presentes también afectan el tratamiento con lisozima, donde algunas afirman efectos inhibidores y otras promueven la lisis a través del tratamiento con lisozima. El cloruro de sodio induce la lisis, pero en altas concentraciones, es un inhibidor activo de la lisis. Se han visto observaciones similares con el uso de sales de potasio. Hay ligeras variaciones debido a las diferencias en las cepas bacterianas. [49] Una consecuencia del uso de lisozima en la extracción de proteínas recombinantes para la cristalización de proteínas es que el cristal puede estar contaminado con unidades de lisozima, produciendo una combinación fisiológicamente irrelevante. De hecho, algunas proteínas simplemente no pueden cristalizar sin dicha contaminación. [50] [51]
Además, la lisozima puede servir como herramienta en la expresión de proteínas recombinantes tóxicas. La expresión de proteínas recombinantes en cepas BL21(DE3) se logra típicamente mediante la T7-ARN-polimerasa. A través de la inducción de IPTG, el represor UV-5 se inhibe, lo que conduce a la transcripción de la T7-ARN-polimerasa y, por lo tanto, de la proteína de interés. No obstante, se observa un nivel basal de la T7-ARN-polimerasa incluso sin inducción. La lisozima T7 actúa como un inhibidor de la T7-ARN-polimerasa. Las cepas recién inventadas, que contienen un plásmido auxiliar (pLysS), coexpresan constitutivamente niveles bajos de lisozima T7, lo que proporciona una alta rigurosidad y una expresión constante de la proteína recombinante tóxica. [52]
La propiedad antibacteriana de la clara de huevo de gallina, debido a la lisozima que contiene, fue observada por primera vez por Laschtschenko en 1909. [53] La actividad bactericida del moco nasal fue demostrada en 1922 por Alexander Fleming , el descubridor de la penicilina , quien acuñó el término "lisozima". [54] Se dice que dijo: "Como esta sustancia tiene propiedades similares a las de los fermentos, la he llamado 'lisozima'". [55] Fleming continuó demostrando que una sustancia enzimática estaba presente en una amplia variedad de secreciones y era capaz de lisar rápidamente (es decir, disolver) diferentes bacterias, particularmente un "coco" amarillo que estudió". [56]
La lisozima fue cristalizada por primera vez por Edward Abraham en 1937, lo que permitió que David Chilton Phillips describiera la estructura tridimensional de la lisozima de clara de huevo de gallina en 1965, cuando obtuvo el primer modelo de resolución de 2 ångström (200 pm ) mediante cristalografía de rayos X. [57] [58] La estructura se presentó públicamente en una conferencia de la Royal Institution en 1965. [59] La lisozima fue la segunda estructura proteica y la primera estructura enzimática en resolverse mediante métodos de difracción de rayos X, y la primera enzima en secuenciarse por completo que contiene los veinte aminoácidos comunes. [60] Como resultado de la elucidación de Phillips de la estructura de la lisozima, también fue la primera enzima en tener un mecanismo específico y detallado sugerido para su método de acción catalítica. [61] [62] [63] Este trabajo llevó a Phillips a proporcionar una explicación de cómo las enzimas aceleran una reacción química en términos de sus estructuras físicas. El mecanismo original propuesto por Phillips fue revisado más recientemente. [19]
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