Agrobacterium tumefaciens [3] [2] (también conocido como Rhizobium radiobacter ) es el agente causal de la enfermedad de la agalla de la corona (la formación de tumores ) en más de 140 especies de eudicotiledóneas . Es una bacteria del suelo con forma de bastón, Gram-negativa . [4] Los síntomas son causados por la inserción de un pequeño segmento de ADN (conocido como T-ADN , por 'ADN de transferencia', que no debe confundirse con el ARNt que transfiere aminoácidos durante la síntesis de proteínas), desde un plásmido en la célula vegetal, [9] que se incorpora en una ubicación semialeatoria en el genoma de la planta . Los genomas de las plantas se pueden diseñar mediante el uso de Agrobacterium para la entrega de secuencias alojadas en vectores binarios de T-ADN .
Agrobacterium tumefaciens es una Alphaproteobacterium de la familia Rhizobiaceae , que incluye a los simbiontes leguminosos fijadores de nitrógeno . A diferencia de los simbiontes fijadores de nitrógeno, las especies de Agrobacterium productoras de tumores son patógenas y no benefician a la planta. La amplia variedad de plantas afectadas por Agrobacterium lo convierte en un tema de gran preocupación para la industria agrícola. [10]
Desde el punto de vista económico, A. tumefaciens es un patógeno grave para los nogales , las vides , las frutas de hueso , los árboles de nueces , la remolacha azucarera , el rábano picante y el ruibarbo , y la naturaleza persistente de los tumores o agallas causados por la enfermedad la hacen especialmente dañina para los cultivos perennes. [11]
Agrobacterium tumefaciens crece de forma óptima a 28 °C (82 °F). El tiempo de duplicación puede variar entre 2,5 y 4 horas según el medio, el formato de cultivo y el nivel de aireación. [12] A temperaturas superiores a 30 °C (86 °F), A. tumefaciens comienza a experimentar un choque térmico que probablemente dé lugar a errores en la división celular. [12]
Para ser virulenta , la bacteria contiene un plásmido inductor de tumores (plásmido Ti o pTi) de 200 kbp de longitud, que contiene el T-ADN y todos los genes necesarios para transferirlo a la célula vegetal. [13] Muchas cepas de A. tumefaciens no contienen un pTi.
Dado que el plásmido Ti es esencial para causar la enfermedad, se producen eventos de prepenetración en la rizosfera para promover la conjugación bacteriana (intercambio de plásmidos entre bacterias). En presencia de opines , A. tumefaciens produce una señal de conjugación difusible llamada N- (3-oxo-octanoil)-L-homoserina lactona (3OC8HSL) o autoinductor de Agrobacterium . [14] Esto activa el factor de transcripción TraR, regulando positivamente la transcripción de genes necesarios para la conjugación. [15]
Agrobacterium tumefaciens infecta la planta a través de su plásmido Ti. El plásmido Ti integra un segmento de su ADN, conocido como T-ADN, en el ADN cromosómico de las células de la planta huésped. A. tumefaciens tiene flagelos que le permiten nadar a través del suelo hacia los fotoasimilados que se acumulan en la rizosfera alrededor de las raíces. Algunas cepas pueden moverse quimiotácticamente hacia los exudados químicos de las plantas, como la acetosiringona y los azúcares, que indican la presencia de una herida en la planta a través de la cual la bacteria puede ingresar. Los compuestos fenólicos son reconocidos por la proteína VirA , una proteína transmembrana codificada en el gen virA en el plásmido Ti. Los azúcares son reconocidos por la proteína chvE, una proteína codificada por un gen cromosómico ubicada en el espacio periplásmico. [16]
Al menos 25 genes vir en el plásmido Ti son necesarios para la inducción de tumores. [17] Además de su papel de percepción, virA y chvE inducen otros genes vir . La proteína VirA tiene actividad de autoquinasa: se fosforila a sí misma en un residuo de histidina. Luego, la proteína VirA fosforila la proteína VirG en su residuo de aspartato. La proteína virG es una proteína citoplasmática producida a partir del gen del plásmido Ti virG . Es un factor de transcripción que induce la transcripción de los operones vir . La proteína ChvE regula el segundo mecanismo de activación de los genes vir . Aumenta la sensibilidad de la proteína VirA a los compuestos fenólicos. [16]
La unión es un proceso de dos pasos. Tras una unión inicial débil y reversible, las bacterias sintetizan fibrillas de celulosa que las anclan a la célula vegetal herida a la que fueron atraídas. Cuatro genes principales están involucrados en este proceso: chvA , chvB , pscA y att . Los productos de los primeros tres genes aparentemente están involucrados en la síntesis real de las fibrillas de celulosa. Estas fibrillas también anclan a las bacterias entre sí, ayudando a formar una microcolonia . [ cita requerida ]
VirC, la proteína virulenta más importante, es un paso necesario en la recombinación de la recolonización ilegítima. Selecciona la sección del ADN de la planta huésped que será reemplazada y corta esta hebra de ADN. [ cita requerida ]
Después de la producción de fibrillas de celulosa, se produce una proteína de membrana externa dependiente de calcio llamada rhicadhesin, que también ayuda a pegar las bacterias a la pared celular. Se pueden encontrar homólogos de esta proteína en otros rizobios. Actualmente, existen varios informes sobre la estandarización del protocolo para la transformación mediada por Agrobacterium . Se ha estudiado el efecto de diferentes parámetros como el tiempo de infección, la acetosiringona, el DTT y la cisteína en la soja ( Glycine max ). [18]
Posibles compuestos vegetales que inician a Agrobacterium para infectar las células vegetales: [19]
Para transferir el ADN-T a una célula vegetal , A. tumefaciens utiliza un mecanismo de secreción de tipo IV, que implica la producción de un pilus -T . Cuando se detectan acetosiringona y otras sustancias, un evento de transducción de señales activa la expresión de 11 genes dentro del operón VirB que son responsables de la formación del pilus-T.
Primero se forma la pro-pilina. Se trata de un polipéptido de 121 aminoácidos que requiere procesamiento mediante la eliminación de 47 residuos para formar una subunidad T-pilus. Se pensaba que la subunidad se circularizaba mediante la formación de un enlace peptídico entre los dos extremos del polipéptido. Sin embargo, la estructura de alta resolución del T-pilus no reveló ninguna ciclización de la pilina, y la organización general de las subunidades de la pilina es muy similar a la de otros pili conjugativos, como el F-pilus. [20]
Los productos de los otros genes VirB se utilizan para transferir las subunidades a través de la membrana plasmática . Los estudios de dos híbridos en levaduras proporcionan evidencia de que VirB6, VirB7, VirB8, VirB9 y VirB10 pueden codificar componentes del transportador. También se requeriría una ATPasa para el transporte activo de las subunidades.
El ADN-T debe ser extraído del plásmido circular. Esto lo hacen normalmente los genes Vir dentro del plásmido auxiliar. [21] Un complejo VirD1/D2 corta el ADN en las secuencias de los bordes izquierdo y derecho. La proteína VirD2 está unida covalentemente al extremo 5'. VirD2 contiene un motivo que hace que el complejo de nucleoproteína se dirija al sistema de secreción de tipo IV (T4SS). La estructura del pilus T mostró que el canal central del pilus es demasiado estrecho para permitir la transferencia del VirD2 plegado, lo que sugiere que VirD2 debe desplegarse parcialmente durante el proceso de conjugación. [20]
En el citoplasma de la célula receptora, el complejo T-ADN se recubre con proteínas VirE2, que se exportan a través del T4SS independientemente del complejo T-ADN. Las señales de localización nuclear , o NLS, ubicadas en VirE2 y VirD2, son reconocidas por la proteína importina alfa, que luego se asocia con la importina beta y el complejo de poro nuclear para transferir el T-ADN al núcleo . VIP1 también parece ser una proteína importante en el proceso, posiblemente actuando como un adaptador para llevar VirE2 a la importina. Una vez dentro del núcleo, VIP2 puede dirigir el T-ADN a áreas de la cromatina que se están transcribiendo activamente, de modo que el T-ADN pueda integrarse en el genoma del huésped.
Para provocar la formación de agallas , el ADN-T codifica genes para la producción de auxina o ácido indol-3-acético a través de la vía IAM. Esta vía biosintética no se utiliza en muchas plantas para la producción de auxina, por lo que significa que la planta no tiene medios moleculares para regularla y la auxina se producirá de forma constitutiva. También se expresan genes para la producción de citoquininas . Esto estimula la proliferación celular y la formación de agallas.
El ADN-T contiene genes para codificar enzimas que hacen que la planta cree derivados de aminoácidos especializados que la bacteria puede metabolizar , llamados opinas . [22] Las opinas son una clase de sustancias químicas que sirven como fuente de nitrógeno para A. tumefaciens , pero no para la mayoría de los demás organismos. El tipo específico de opina producida por las plantas infectadas con A. tumefaciens C58 es la nopalina . [23]
Dos plásmidos de tipo nopalina Ti , pTi-SAKURA y pTiC58, fueron completamente secuenciados. " A. fabrum " C58, el primer patovar completamente secuenciado , fue aislado por primera vez de una agalla de la corona de un cerezo. El genoma fue secuenciado simultáneamente por Goodner et al. [24] y Wood et al. [25] en 2001. El genoma de A. tumefaciens C58 consiste en un cromosoma circular, dos plásmidos y un cromosoma lineal . La presencia de un cromosoma circular unido covalentemente es común en Bacteria, con pocas excepciones. Sin embargo, la presencia de un solo cromosoma circular y un solo cromosoma lineal es exclusiva de un grupo en este género. Los dos plásmidos son pTiC58, responsable de los procesos involucrados en la virulencia , y pAtC58, [b] alguna vez llamado el plásmido "críptico". [24] [25]
Se ha demostrado que el plásmido pAtC58 está involucrado en el metabolismo de las opinas y se conjuga con otras bacterias en ausencia del plásmido pTiC58. [26] Si se elimina el plásmido Ti, no se produce el crecimiento del tumor que es el medio para clasificar a esta especie de bacteria.
La Conferencia de Asilomar en 1975 estableció un amplio acuerdo de que las técnicas recombinantes no se entendían lo suficiente y necesitaban ser controladas estrictamente. [27] [28] Las capacidades de transmisión de ADN de Agrobacterium se han explorado ampliamente en biotecnología como un medio para insertar genes extraños en plantas. Poco después de la Conferencia de Asilomar, Marc Van Montagu y Jeff Schell descubrieron el mecanismo de transferencia de genes entre Agrobacterium y plantas, lo que resultó en el desarrollo de métodos para alterar la bacteria en un sistema de entrega eficiente para la ingeniería genética en plantas. [29] El plásmido T-ADN que se transfiere a la planta es un vehículo ideal para la ingeniería genética. [30] Esto se hace clonando una secuencia genética deseada en vectores binarios de T-ADN que se usarán para entregar una secuencia de interés a células eucariotas. Este proceso se ha realizado utilizando el gen de luciferasa de luciérnaga para producir plantas brillantes. [31] Esta luminiscencia ha sido un dispositivo útil en el estudio de la función del cloroplasto de la planta y como gen reportero . [31] También es posible transformar Arabidopsis thaliana sumergiendo las flores en un caldo de Agrobacterium : la semilla producida será transgénica . En condiciones de laboratorio, el ADN-T también se ha transferido a células humanas, lo que demuestra la diversidad de aplicaciones de inserción. [32]
El mecanismo por el cual Agrobacterium inserta materiales en la célula huésped es mediante un sistema de secreción de tipo IV que es muy similar a los mecanismos utilizados por los patógenos para insertar materiales (generalmente proteínas ) en las células humanas mediante secreción de tipo III. También emplea un tipo de señalización conservada en muchas bacterias Gram-negativas llamada detección de quórum . [ cita requerida ] Esto también convierte a Agrobacterium en un tema importante de investigación médica. [ cita requerida ]
La transformación genética natural en bacterias es un proceso sexual que implica la transferencia de ADN de una célula a otra a través del medio intermedio y la integración de la secuencia donante en el genoma receptor mediante recombinación homóloga . A. tumefaciens puede experimentar una transformación natural en el suelo sin ningún tratamiento físico o químico específico. [33]
Agrobacterium tumefaciens hiberna en suelos infestados. Las especies de Agrobacterium viven predominantemente estilos de vida saprofitos, por lo que es común que incluso las especies fitoparásitas de este género sobrevivan en el suelo durante largos períodos de tiempo, incluso sin la presencia de una planta huésped. [34] Sin embargo, cuando hay una planta huésped presente, las bacterias ingresan al tejido vegetal a través de heridas recientes o aberturas naturales de raíces o tallos cerca del suelo. Estas heridas pueden ser causadas por prácticas culturales, injertos, insectos, etc. Una vez que las bacterias han ingresado a la planta, se producen intercelularmente y estimulan la proliferación del tejido circundante debido a la transformación celular. Agrobacterium realiza este control insertando el ADN-T plasmídico en el genoma de la planta. Consulte más arriba para obtener más detalles sobre el proceso de inserción del ADN plasmídico en el genoma del huésped. El crecimiento excesivo del tejido vegetal conduce a la formación de agallas en el tallo y las raíces. Estos tumores ejercen una presión significativa sobre el tejido vegetal circundante, lo que hace que este tejido se aplaste y/o deforme. Los vasos aplastados provocan una reducción del flujo de agua en el xilema. Los tumores jóvenes son blandos y, por lo tanto, vulnerables a la invasión secundaria de insectos y microorganismos saprofitos. Esta invasión secundaria provoca la descomposición de las capas celulares periféricas, así como la decoloración del tumor debido a la descomposición. La descomposición del tejido blando provoca la liberación de Agrobacterium tumefaciens en el suelo, lo que le permite reiniciar el proceso de la enfermedad con una nueva planta hospedante. [35]
La enfermedad de la agalla de la corona causada por Agrobacterium tumefaciens se puede controlar mediante el uso de varios métodos. La mejor manera de controlar esta enfermedad es tomar medidas preventivas, como esterilizar las herramientas de poda para evitar infectar nuevas plantas. Realizar inspecciones obligatorias del material de vivero y rechazar las plantas infectadas, así como no plantar plantas susceptibles en campos infectados, también son prácticas valiosas. Evitar herir las coronas/raíces de las plantas durante el cultivo es importante para prevenir la enfermedad. En las técnicas hortícolas en las que se unen varias plantas para crecer como una sola, como la brotación y el injerto [36], estas técnicas provocan heridas en las plantas. Las heridas son el lugar principal de entrada de bacterias en la planta huésped. Por lo tanto, es aconsejable realizar estas técnicas durante las épocas del año en las que las Agrobacterias no están activas. El control de los insectos masticadores de raíces también es útil para reducir los niveles de infección, ya que estos insectos causan heridas (también conocidas como vías de entrada de bacterias) en las raíces de las plantas. [35] Se recomienda que el material vegetal infectado se queme en lugar de colocarlo en una pila de abono debido a la capacidad de las bacterias de vivir en el suelo durante muchos años. [37]
Los métodos de control biológico también se utilizan para controlar esta enfermedad. Durante los años 1970 y 1980, una práctica común para tratar las semillas germinadas, las plántulas y los portainjertos era remojarlos en una suspensión de K84. K84 es una cepa de Rhizobium rhizogenes [38] (anteriormente clasificada como A. radiobacter , pero luego reclasificada) que es una especie relacionada con A. tumefaciens pero no es patógena. K84 produce una bacteriocina (agrocin 84) que es un antibiótico específico contra bacterias relacionadas, incluida A. tumefaciens . Este método, que tuvo éxito en el control de la enfermedad a escala comercial, tenía el riesgo de que K84 transfiriera su gen de resistencia a la patógena Agrobacteria . Por lo tanto, en la década de 1990, se creó una cepa mutante de deleción basada en K84, conocida como K1026. Esta cepa es tan exitosa en el control de la agalla de la corona como K84 sin la advertencia de la transferencia del gen de resistencia. [39] [40]
El huésped, el medio ambiente y el patógeno son conceptos extremadamente importantes en lo que respecta a la patología vegetal. Las agrobacterias tienen el rango de huéspedes más amplio de cualquier patógeno vegetal, [41] por lo que el factor principal a tener en cuenta en el caso de la agalla de la corona es el medio ambiente. Hay varias condiciones y factores que crean un entorno propicio para A. tumefaciens cuando infecta a sus diversos huéspedes. La bacteria no puede penetrar en la planta huésped sin un punto de entrada como una herida. Los factores que conducen a heridas en las plantas incluyen prácticas culturales, injertos, lesiones por congelación, grietas de crecimiento, insectos del suelo y otros animales en el medio ambiente que causan daños a la planta. En consecuencia, en inviernos excepcionalmente duros, es común tener una mayor incidencia de agalla de la corona debido al daño relacionado con el clima. [42] Junto con esto, existen métodos para mediar la infección de la planta huésped. Por ejemplo, los nematodos pueden actuar como un vector para introducir Agrobacterium en las raíces de las plantas. Más específicamente, los nematodos parásitos de la raíz dañan la célula de la planta, creando una herida por la que ingresa la bacteria. [43] Finalmente, la temperatura es un factor a tener en cuenta a la hora de considerar la infección por A. tumefaciens . La temperatura óptima para la formación de agallas de corona debido a esta bacteria es de 22 °C (72 °F) debido a la termosensibilidad de la transferencia de ADN-T. La formación de tumores se reduce significativamente en condiciones de temperatura más altas. [44]
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