La zona de actividad polarizante (ZPA) es un área del mesénquima que contiene señales que indican al esbozo de la extremidad en desarrollo que se debe formar a lo largo del eje anterior/posterior. El esbozo de la extremidad es un mesénquima indiferenciado rodeado por una cubierta de ectodermo . Con el tiempo, el esbozo de la extremidad se desarrolla en huesos, tendones, músculos y articulaciones. El desarrollo del esbozo de la extremidad depende no solo de la ZPA, sino también de muchos genes diferentes, señales y una región única del ectodermo llamada cresta ectodérmica apical (AER). La investigación de Saunders y Gasseling en 1948 identificó la AER y su posterior participación en el crecimiento proximal distal. [1] Veinte años después, el mismo grupo realizó estudios de trasplante en esbozos de extremidades de pollos e identificó la ZPA. No fue hasta 1993 que Todt y Fallon demostraron que la AER y la ZPA dependen una de la otra. [2]
La formación de patrones a lo largo de la yema de la extremidad requiere señales de muchas fuentes. En concreto, las proteínas llamadas factores de transcripción (TF) ayudan a controlar la velocidad a la que se transcribe un gen. La yema de la extremidad expresa un TF llamado ALX4 en la parte anterior del mesodermo , y el TF HOXB8 se expresa en la parte posterior. La región Alx4, la región medial y el área de expresión de Hox8 se unen en un área proximal donde se desarrolla el AER. El ZPA se forma donde la región Hox8 se une al AER.
Estas regiones dependen de la señalización para que se produzcan los eventos de inducción adecuados. El AER expresa FGF8 , que induce la expresión de Shh en el mesodermo posterior. Shh luego estimula la expresión de FGF4 en la parte posterior del AER. Después de estos eventos, existe una codependencia entre FGF-4 y Shh para su posterior expresión y mantenimiento. Además, Wnt7a se expresa en el ectodermo dorsal, lo que es necesario para mantener la señalización de FGF y Shh. [3]
En 1948, Saunders y Gasseling publicaron datos en el Journal of Experimental Biology que mostraban que las marcas de referencia insertadas cerca del borde apical de la yema del ala se encuentran dispersas por todo el antebrazo del ala. [1] Esto los llevó a creer que el ectodermo apical puede desempeñar un papel en la formación de partes del ala. Para comprobarlo, eliminaron el ectodermo apical de las yemas del ala, lo que produjo alas deformadas. Cuando eliminaron el ectodermo dorsal, se formaron alas normales. Estos resultados mostraron que las células del ectodermo apical tienen un destino preciso para formar regiones específicas del ala.
En 1968, Saunders y Gasseling realizaron estudios de trasplante utilizando tejido de yema de extremidad de pollo. [4] Extrajeron células de la región posterior de la extremidad, las trasplantaron a la región anterior y notaron que se formaban dedos adicionales en el área anterior y estos dedos eran imágenes especulares de los normales. Este mesénquima posterior era el ZPA, que ahora se sabe que expresa la proteína sonic hedgehog (Shh). Una hipótesis es que en altas concentraciones, este morfógeno desconocido causa la formación de mesénquima en el lado posterior, mientras que las concentraciones bajas inducen la formación de mesénquima en el extremo anterior. [5] La identificación de este morfógeno fue el siguiente paso crucial. La primera hipótesis provino de Tickle et al., quienes demostraron que cuando el ácido retinoico se coloca en el margen anterior de la yema de la extremidad, se producen duplicaciones de imagen especular. [6] Sin embargo, las concentraciones de ácido retinoico que causan duplicaciones de imagen especular inducen altos niveles de un gen posterior, el receptor de ácido retinoico Beta, que no se ve en la región posterior. [7] Ahora se sabe que el ácido retinoico endógeno actúa de manera permisiva antes de la iniciación de la yema de la extremidad para permitir que comience el proceso de gemación, [8] y que el morfógeno específico, que se supone que es Shh, [9] normalmente se expresa independientemente del ácido retinoico en la región posterior de la yema de la extremidad. Al observar los homólogos de señalización de otros organismos, el gen de segmentación de Drosophila , hedgehog, sirvió como un candidato viable. [10]
La idea de que Shh es necesaria para la señalización ZPA adecuada y la formación de las extremidades anterior/posteriores necesitaba ser puesta a prueba. Riddle et al. llevaron los hallazgos de Saunders y Gasselings al siguiente nivel y demostraron que Shh es el morfógeno dentro de la ZPA que se requiere para la formación de patrones anteroposteriores. [9] Al aislar el gen Shh e implantarlo en el brote de la extremidad anterior, se formaron duplicaciones de dedos en imagen especular.
El aislamiento se realizó mediante el diseño de iniciadores de PCR que corresponden a secuencias de Shh que se conservan en Drosophila y el ratón y que participan en la formación de yemas de las extremidades. Luego, el clon se utilizó como plantilla para analizar una biblioteca de ADNc a partir del ARN de yemas de las extremidades en etapa 22. El grupo expresó ectópicamente el gen aprovechando un vector retroviral para insertar el ADNc en células de pollo. Existen tipos únicos de este vector retroviral que solo infectan cepas específicas de especies aviares. Por lo tanto, este grupo utilizó un vector retroviral denominado RCAS-E, que carece de una proteína de envoltura de tipo E y es capaz de infectar ciertos fibroblastos de embriones de pollo con Shh.
Los resultados mostraron duplicaciones de dígitos, siendo la más común la 4-3-3-4, con la ausencia del dígito 2. Aunque hubo variabilidad, fue claramente consistente con el patrón posicional anterior a posterior. Las variaciones se debieron a la cantidad de tejido injertado y a la ubicación del injerto. Estos hallazgos indican que Shh podría sustituir la función de la ZPA. Por lo tanto, Shh es suficiente para la acción de la ZPA.
Shh puede ser una señal crítica que regula la función de ZPA, pero los genes involucrados en la señalización de Shh están bajo el control de varios otros factores que son necesarios para el mantenimiento y la función de ZPA, incluidos Hand2 y Hoxb-8. El ácido retinoico , una molécula de señalización importante necesaria durante la embriogénesis, actúa a través de los genes Hox. Originalmente se postuló que el ácido retinoico actúa para inducir el gen Hoxb-8, [11] pero esta hipótesis no ha sido apoyada por estudios genéticos en embriones de ratón que carecen de síntesis de ácido retinoico que aún expresan Hoxb-8 en la extremidad. [8] La señalización de Hoxb-8 está activa en el embrión temprano, comenzando en el extremo posterior del mesodermo de la placa lateral y extendiéndose a la región anterior. A medida que Hoxb-8 se extiende a regiones más anteriores, Shh se induce en el área que se convertirá en ZPA. Shh solo se induce en la región anterior debido a las señales del AER. Experimentos realizados por Heikinheimo et al. muestran que cuando se elimina el AER, las perlas que expresan FGF son suficientes para inducir la señalización de Shh en el ZPA. [12] Por lo tanto, el factor de señalización probable del AER es FGF.
Además, cuando se elimina el AER, Shh ya no se expresa y el ZPA ya no se puede mantener. Actuando en un mecanismo de retroalimentación positiva, FGF-4 se expresa cerca del ZPA. [13] FGF-4 actúa para mantener la expresión de Shh, mientras que Shh actúa para mantener la expresión de FGF-4. Al mismo tiempo, Wnt-7a se expresa en el ectodermo dorsal y proporciona una retroalimentación positiva adicional a FGF-4 y Shh. [14] Sin este sistema, las extremidades y los dedos se reducen significativamente o faltan.
Los objetivos posteriores que se activan en respuesta a Shh plantean otro desafío. Los genes que son objetivos de la señalización de Shh codifican factores que conducen a la formación del autópodo , el estilópodo y el zeugópodo .
La activación de los factores de transcripción de zinc-finger de Gli ocurre a través de la vía de señalización Hedgehog . Hay tres factores Gli que son esenciales para el desarrollo de las extremidades: Gli1 , Gli2 y Gli3 . Sin Shh, Gli2 y Gli3 se procesan a una forma represora y viajan al núcleo para reprimir la respuesta Shh. Pero cuando Shh está presente, Gli2 y Gli3 sin procesar pueden pasar al núcleo y estimular la expresión de los genes diana de Shh, incluido Gli1. Los estudios en ratones muestran que los knockouts de Gli3 tienen dedos polidactilia . [15] Fundamentalmente, Shh actúa para eliminar la represión de Gli3. Cuando Shh se difunde desde el ZPA, predomina en la región posterior de la yema de la extremidad, activando Gli3 en la región posterior, mientras que el represor todavía está activo en la región anterior. Esto conduce a la activación de otros genes como los genes Hox, los genes FGF y los genes BMP en la región posterior, estableciendo el patrón de los dedos. La BMP desempeña un papel en la morfología de las extremidades, específicamente en el posicionamiento de los dedos, pero la regulación específica de la BMP no está clara.
En particular, es probable que los genes Hox A y D estén controlados por Shh dentro del ZPA. [16] Tres fases de activación de los genes Hox dan como resultado la formación de patrones en la extremidad en paralelo a la expresión de los genes Hox en un patrón anidado. La activación de estos genes da como resultado un nuevo eje de la extremidad que, en última instancia, da como resultado el desarrollo del dígito, posiblemente interpretando la expresión genética para asignar la identidad del dígito. En general, el ZPA molecular requiere información para varios centros de señalización, pero actúa como un organizador en sí mismo, induciendo la formación de patrones anteroposteriores de la yema de la extremidad del pollo.
