Una prueba de ácido nucleico ( NAT ) es una técnica utilizada para detectar una secuencia particular de ácido nucleico y, por lo tanto, generalmente para detectar e identificar una especie o subespecie particular de organismo, a menudo un virus o bacteria que actúa como patógeno en sangre , tejido , orina , etc. Las NAT se diferencian de otras pruebas en que detectan materiales genéticos ( ARN o ADN ) en lugar de antígenos o anticuerpos . La detección de materiales genéticos permite un diagnóstico temprano de una enfermedad porque la detección de antígenos y/o anticuerpos requiere tiempo para que comiencen a aparecer en el torrente sanguíneo. [1] Dado que la cantidad de un determinado material genético suele ser muy pequeña, muchas NAT incluyen un paso que amplifica el material genético, es decir, hace muchas copias del mismo. Estas NAT se denominan pruebas de amplificación de ácidos nucleicos ( NAAT ). Hay varias formas de amplificación, incluida la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el ensayo de desplazamiento de cadena (SDA), el ensayo mediado por transcripción (TMA), [2] y la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). [3]
Prácticamente todos los métodos de amplificación de ácidos nucleicos y tecnologías de detección utilizan la especificidad del emparejamiento de bases Watson-Crick; las moléculas de sonda o cebador monocatenario capturan moléculas diana de ADN o ARN de cadenas complementarias . Por lo tanto, el diseño de las cadenas de sonda es muy importante para aumentar la sensibilidad y especificidad de la detección. Sin embargo, los mutantes que forman la base genética de una variedad de enfermedades humanas suelen ser ligeramente diferentes de los ácidos nucleicos normales. A menudo, solo se diferencian en una única base, por ejemplo, inserciones , deleciones y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). En este caso, puede producirse fácilmente una unión imperfecta de la sonda al objetivo, lo que da lugar a resultados falsos positivos , como confundir una cepa comensal con una patógena. Se ha dedicado mucha investigación a lograr la especificidad de una única base.
Las cadenas de ácido nucleico (ADN y ARN) con sus secuencias correspondientes se unen en pares, uniéndose como si fueran cintas de velcro que se enrollan en una secadora de ropa. Sin embargo, cada nodo de la cadena no es muy pegajoso, por lo que la cadena de doble cadena se abre y se cierra de forma continua bajo la influencia de las vibraciones ambientales (lo que se conoce como ruido térmico o movimiento browniano ). Los emparejamientos más largos son más estables. Las pruebas de ácido nucleico utilizan una "sonda", que es una cadena larga con una cadena corta pegada a ella. La cadena larga del cebador tiene una secuencia correspondiente (complementaria) a una cadena "objetivo" del organismo patógeno que se está detectando. La cadena patógena se adhiere firmemente a la parte expuesta de la cadena larga del cebador (llamada "punto de apoyo") y, poco a poco, desplaza la cadena corta "protectora" de la sonda. Al final, la cadena corta protectora no está unida a nada y el cebador corto no unido es detectable. El resto de esta sección brinda información histórica sobre la investigación necesaria para perfeccionar este proceso y convertirlo en una prueba útil.
En 2012, el grupo de investigación de Yin publicó un artículo sobre la optimización de la especificidad de la hibridación de ácidos nucleicos. [4] Introdujeron una 'sonda de intercambio de puntos de apoyo (PC)' que consiste en una cadena de complemento prehibridada C y una cadena protectora P. La cadena de complemento es más larga que la cadena protectora para tener una cola no unida en el extremo, un punto de apoyo. El complemento es perfectamente complementario con la secuencia diana. Cuando la diana correcta (X) reacciona con la sonda de intercambio de puntos de apoyo (PC), se libera P y se forma el producto hibridado XC. La energía libre estándar (∆) de la reacción es cercana a cero. Por otro lado, si la sonda de intercambio de puntos de apoyo (PC) reacciona con la diana falsa (S), la reacción avanza, pero la energía libre estándar aumenta para ser menos favorable termodinámicamente. La diferencia de energía libre estándar (∆∆) es lo suficientemente significativa como para dar una discriminación obvia en el rendimiento. El factor de discriminación Q se calcula como el rendimiento de la hibridación de la diana correcta dividido por el rendimiento de la hibridación de la diana falsa. A través de los experimentos en diferentes sondas de intercambio de puntos de apoyo con 5 objetivos correctos y 55 objetivos espurios con cambios de base única energéticamente representativos (reemplazos, deleciones e inserciones), el grupo de Yin concluyó que los factores de discriminación de estas sondas estaban entre 3 y 100 + con la mediana de 26. Las sondas funcionan robustamente de 10 °C a 37 °C, de 1 mM a 47 mM, y con concentraciones de ácido nucleico de 1 nM a 5 M. También descubrieron que las sondas de intercambio de puntos de apoyo funcionan robustamente incluso en la detección de ARN.
Posteriormente se realizaron otras investigaciones. En 2013, el grupo de Seelig publicó un artículo sobre sondas moleculares fluorescentes que también utilizan la reacción de intercambio de puntos de apoyo. [5] Esto permitió la detección óptica del objetivo correcto y del objetivo de SNP. También lograron detectar SNP en muestras derivadas de E. coli.
En 2015, el grupo de David logró una selectividad extremadamente alta (más de 1000) de variantes de un solo nucleótido (SNV) al introducir el sistema llamado "composiciones competitivas". [6] En este sistema, construyeron un modelo de reacción cinética de los procesos de hibridación subyacentes para predecir los valores óptimos de los parámetros, que varían en función de las secuencias de SNV y de tipo salvaje (WT), de la arquitectura de diseño de la sonda y el receptor, y de las concentraciones de reactivos y las condiciones del ensayo. Su modelo logró una selectividad media de 890 veces para 44 SNV de ADN relacionadas con el cáncer, con un mínimo de 200, lo que representa al menos una mejora de 30 veces con respecto a los ensayos previos basados en hibridación. Además, aplicaron esta tecnología para ensayar secuencias de VAF bajas de ADN genómico humano después de PCR, así como directamente a secuencias de ARN sintético.
Basándose en su experiencia, desarrollaron un nuevo método de PCR llamado Amplificación por Desplazamiento de Bloqueadores (BDA). [7] Es una PCR robusta a la temperatura que amplifica selectivamente todas las variantes de secuencia dentro de una ventana de aproximadamente 20 nt por 1000 veces más que las secuencias de tipo salvaje, lo que permite una fácil detección y cuantificación de cientos de variantes potenciales originalmente en ≤ 0,1% de frecuencia alélica. BDA logra un rendimiento de enriquecimiento similar en todas las temperaturas de hibridación que van desde 56 °C a 64 °C. Esta robustez de la temperatura facilita el enriquecimiento multiplexado de muchas variantes diferentes en todo el genoma y, además, permite el uso de instrumentos de termociclado económicos y portátiles para la detección de variantes de ADN raras. BDA ha sido validada incluso en tipos de muestra que incluyen muestras de ADN clínico libre de células recolectadas del plasma sanguíneo de pacientes con cáncer de pulmón.