La glutamina sintetasa utiliza amoníaco producido por la reducción de nitratos, la degradación de aminoácidos y la fotorrespiración . [4] El grupo amida del glutamato es una fuente de nitrógeno para la síntesis de metabolitos de la vía de la glutamina . [5]
Otras reacciones pueden tener lugar a través de GS. La competencia entre el ion amonio y el agua, sus afinidades de unión y la concentración del ion amonio influyen en la síntesis y la hidrólisis de la glutamina. La glutamina se forma si un ion amonio ataca al intermedio acil-fosfato, mientras que el glutamato se rehace si el agua ataca al intermedio. [6] [7] El ion amonio se une más fuertemente que el agua a GS debido a las fuerzas electrostáticas entre un catión y una bolsa cargada negativamente. [4] Otra posible reacción es que al unirse NH 2 OH a GS, en lugar de NH 4 +, se produce γ-glutamilhidroxamato. [6] [7]
Estructura
La glutamina sintetasa puede estar compuesta por 8, 10 o 12 subunidades idénticas separadas en dos anillos cara a cara. [6] [8] [9] [10] Los GS bacterianos son dodecámeros con 12 sitios activos entre cada monómero . [6] Cada sitio activo crea un "túnel" que es el sitio de tres sitios de unión de sustrato distintos: nucleótido , ion amonio y aminoácido. [4] [6] [10] [11] El ATP se une a la parte superior del biembudo que se abre a la superficie externa de GS. [4] El glutamato se une en la parte inferior del sitio activo. [7] La mitad del bifunnel contiene dos sitios en los que se unen cationes divalentes (Mn+2 o Mg+2). Un sitio de unión de cationes participa en la transferencia de fosforilo de ATP a glutamato, mientras que el segundo estabiliza el GS activo y ayuda con la unión de glutamato. [6]
Los enlaces de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas mantienen unidos los dos anillos de GS. Cada subunidad posee un extremo C y un extremo N en su secuencia. El extremo C terminal (tanga helicoidal) estabiliza la estructura GS insertándose en la región hidrofóbica de la subunidad a través del otro anillo. El extremo N está expuesto al disolvente. Además, el canal central se forma a través de seis láminas β de cuatro cadenas compuestas por bucles antiparalelos de las doce subunidades. [6]
Mecanismo
GS cataliza la condensación de glutamato con amoníaco dependiente de ATP para producir glutamina. [4] La hidrólisis del ATP impulsa [8] el primer paso de un mecanismo concertado de dos partes. [4] [6] El ATP fosforila el glutamato para formar ADP y un intermedio de acil-fosfato, γ-glutamil fosfato, que reacciona con el amoníaco, formando glutamina y fosfato inorgánico. El ADP y el Pi no se disocian hasta que se une el amoníaco y se libera glutamina. [6]
El ATP se une primero a la parte superior del sitio activo cerca de un sitio de unión de cationes, mientras que el glutamato se une cerca del segundo sitio de unión de cationes en la parte inferior del sitio activo. [5] [7] La presencia de ADP provoca un cambio conformacional en GS que estabiliza el resto de γ-glutamil fosfato. El amonio se une fuertemente a GS sólo si el intermedio acil-fosfato está presente. El amonio, en lugar del amoníaco, se une a GS porque el sitio de unión es polar y está expuesto al solvente. [7] En el segundo paso, la desprotonación del amonio permite que el amoníaco ataque al intermediario desde su sitio cercano para formar glutamina. [12] El fosfato sale por la parte superior del sitio activo, mientras que la glutamina sale por la parte inferior (entre dos anillos). [13] [7]
función biológica
GS está presente predominantemente en el cerebro, los riñones y el hígado. [4] [10] GS en el cerebro participa en la regulación metabólica del glutamato, la desintoxicación del amoníaco cerebral, la asimilación del amoníaco, la reciclación de neurotransmisores y la terminación de las señales de los neurotransmisores. [4] [14] GS, en el cerebro, se encuentra principalmente en los astrocitos . [15] Los astrocitos protegen a las neuronas contra la excitotoxicidad al absorber el exceso de amoníaco y glutamato. [14] En ambientes hiperamonémicos (altos niveles de amoníaco), se produce inflamación astroglial. [14] [16] [17] Diferentes perspectivas han abordado el problema de la inflamación astroglial. Un estudio muestra que se producen cambios morfológicos que aumentan la expresión de GS en áreas glutamatérgicas u otras adaptaciones que alivian los altos niveles de glutamato y amoníaco. [14] Otra perspectiva es que la inflamación de los astrocitos se debe a la acumulación de glutamina. Para prevenir niveles elevados de glutamato cortical y contenido de agua cortical, se realizó un estudio para prevenir la actividad GS en ratas mediante el uso de MSO. [dieciséis]
Clases
Parece haber tres clases diferentes de GS: [18] [19] [20]
Las enzimas de clase I (GSI) son específicas de procariotas y son oligómeros de 12 subunidades idénticas . [21] La actividad de la enzima de tipo GSI está controlada por la adenilación de un residuo de tirosina . La enzima adenilada está inactiva. [22]
Las enzimas de clase II (GSII) se encuentran en eucariotas y en bacterias pertenecientes a las familias Rhizobiaceae , Frankiaceae y Streptomycetaceae (estas bacterias también tienen una GS de clase I). Los GSII son decámeros de subunidades idénticas. [10] AP : 2OJW .
Las plantas tienen dos o más isoenzimas de GSII, una de las isoenzimas se transloca al cloroplasto . Otra forma es citosólica . La traducción del gen GS citosólico está regulada por su región no traducida 5' (UTR), mientras que su UTR 3' desempeña un papel en el recambio de transcripción. [23]
Actualmente, las enzimas de clase III (GSIII) solo se han encontrado en Bacteroides fragilis y en Butyrivibrio fibrisolvens . Es un dodecámero de doble anillo de cadenas idénticas. [24] Es mucho más grande (alrededor de 700 aminoácidos) que las enzimas GSI (450 a 470 aminoácidos) o GSII (350 a 420 aminoácidos).
Si bien las tres clases de GS están claramente relacionadas estructuralmente, las similitudes de secuencia no son tan extensas.
Regulación e inhibición
GS está sujeto a modificación covalente reversible. Tyr 397 de las 12 subunidades puede sufrir adenililación o muerte por adenilil transferasa (AT), una enzima reguladora bifuncional. [25] La adenililación es una modificación postraduccional que implica la unión covalente de AMP a una cadena lateral de proteína. Cada adenililación requiere un ATP y la inhibición completa de GS requiere 12 ATP. La deadenililación por AT implica la eliminación fosforolítica de los grupos adenililo unidos a Tyr como ADP . La actividad de AT está influenciada por la proteína reguladora que está asociada a ella: P II , un trímero de 44 kD . [25] P II también sufre una modificación postraduccional por la uridilil transferasa , por lo que P II tiene dos formas. El estado de P II dicta la actividad de la adenilil transferasa. Si P II no está uridilado, tomará la forma P IIA . El complejo AT:P IIA desactivará GS mediante adenililación. Si P II está uridilado, tomará la forma P IID . El complejo AT:P IID activará GS por muerte. [25] Los complejos AT:P IIA y AT:P IID están regulados alostéricamente de forma recíproca por α-cetoglutarato (α-KG) y glutamina (Gln). Gln activará la actividad AT:P IIA e inhibirá AT:P IID , lo que provocará la adenililación y la posterior desactivación de GS. Además, Gln favorece la conversión de P IID a P IIA . Los efectos de α-KG sobre los complejos son opuestos. [25] En la mayoría de las bacterias gramnegativas, GS puede modificarse mediante adenililación (algunas cianobacterias y algas verdes o excepciones). [26]
La inhibición de GS se ha centrado en gran medida en los ligandos del sitio amino. [6] Otros inhibidores son el resultado del metabolismo de la glutamina: triptófano, histidina, carbamoil fosfato, glucosamina-6-fosfato, citidina trifosfato (CTP) y adenosina monofosfato (AMP). [5] [8] [27] Otros inhibidores/reguladores son la glicina y la alanina. La alanina, la glicina y la serina se unen al sitio del sustrato glutamato. GDP, AMP, ADP se unen al sitio ATP. [6] La L-serina, la L-alanina y la glicina se unen al sitio del L-glutamato en GS no adinilado. Los cuatro aminoácidos se unen al sitio mediante sus átomos comunes, "la cadena principal" de aminoácidos. [5] El glutamato es otro producto del metabolismo de la glutamina; sin embargo, el glutamato es un sustrato de GS que lo inhibe para actuar como regulador de GS.2 Cada inhibidor puede reducir la actividad de la enzima; Una vez que todos los metabolitos finales de glutamina se unen a GS, la actividad de GS se inhibe casi por completo. [8] Muchas señales de entrada inhibidoras permiten un ajuste fino de GS al reflejar los niveles de nitrógeno en el organismo.
La regulación por retroalimentación distingue la diferencia entre dos tipos eucariotas de GS: tejido cerebral y no cerebral. La GS no cerebral responde a la inhibición de la retroalimentación del producto final, mientras que la GS cerebral no. [6] Las concentraciones altas de metabolitos dependientes de glutamina deberían inhibir la actividad de GS, mientras que las concentraciones bajas deberían activar la actividad de GS. [6]
Inhibidores:
Metionina sulfoximina (MSO): MSO es un inhibidor que se une al sitio del glutamato. Unida a GS, la MSO es fosforilada por ATP, lo que da como resultado una inhibición irreversible y no covalente de GS. La configuración del isómero S es más inhibidora. [6] La entrada de glutamato se bloquea en el sitio activo mediante una estabilización del bucle flexible en el sitio activo por MSO. [7]
Fosfinotricina [1] (PPT, glufosinato): la fosfinotricina es un inhibidor que se une al sitio del glutamato. El glufosinato se utiliza como herbicida. Las plantas tratadas con glufosinato mueren debido a la acumulación de amoníaco y al cese de la fotosíntesis. [10]
En la actualidad se encuentran disponibles muchos inhibidores sintéticos. [6]
La investigación sobre E. coli reveló que GS se regula mediante la expresión genética. El gen que codifica la subunidad GS se denomina glnA . La transcripción de glnA depende de NRI ( un potenciador transcripcional específico ). La transcripción activa ocurre si NR I está en su forma fosforilada, denominada NR I -P . La fosforilación de NR I está catalizada por NR II , una proteína quinasa . Si NR II forma un complejo con P IIA , funcionará como una fosfatasa y NR I -P se convierte nuevamente en NR I. En este caso, cesa la transcripción de glnA . [25]
GS está sujeto a mecanismos reguladores completamente diferentes en las cianobacterias . [28] En lugar del sistema común de dos componentes NtrC-NtrB, [29] [30] las cianobacterias albergan el regulador transcripcional NtcA que está restringido a este clado y controla la expresión de GS y una multitud de genes implicados en el metabolismo del nitrógeno . [31] [32] Además, la GS en las cianobacterias no se modifica covalentemente para aumentar la sensibilidad a la inhibición por retroalimentación. [30] En cambio, la GS en las cianobacterias es inhibida por pequeñas proteínas, denominadas factores inactivadores de GS (IF), cuya transcripción está regulada negativamente por NtcA. [33] [34] Estos factores inactivantes están además regulados por diferentes ARN no codificantes : el sRNA NsiR4 interactúa con la 5'UTR del mRNA del factor inactivante GS IF7 ( gifA mRNA) y reduce su expresión. La expresión de NsiR4 está bajo control positivo del factor de transcripción de control de nitrógeno NtcA. [35] Además, la expresión del factor inactivador de GS IF17 está controlada por un riboswitch de unión a glutamina . [36]
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enlaces externos
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PDBe-KB proporciona una descripción general de toda la información estructural disponible en el PDB para la glutamina sintetasa humana