La cromatografía iónica (o cromatografía de intercambio iónico ) es una forma de cromatografía que separa iones y moléculas polares ionizables en función de su afinidad con el intercambiador de iones . [1] Funciona con casi cualquier tipo de molécula cargada , incluidos pequeños aniones inorgánicos , [2] proteínas grandes , [3] nucleótidos pequeños , [4] y aminoácidos . Sin embargo, la cromatografía iónica debe realizarse en condiciones que estén a una unidad de pH del punto isoeléctrico de una proteína. [5]
Los dos tipos de cromatografía iónica son el intercambio aniónico y el intercambio catiónico. La cromatografía de intercambio catiónico se utiliza cuando la molécula de interés está cargada positivamente. La molécula está cargada positivamente porque el pH de la cromatografía es menor que el pI (también conocido como pH(I)). [6] En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria está cargada negativamente y las moléculas cargadas positivamente se cargan para ser atraídas hacia ella. La cromatografía de intercambio aniónico es cuando la fase estacionaria está cargada positivamente y las moléculas cargadas negativamente (lo que significa que el pH para la cromatografía es mayor que el pI) se cargan para ser atraídas hacia ella. [7] Se utiliza a menudo en la purificación de proteínas, análisis de agua, [8] [9] y control de calidad. Las moléculas cargadas y solubles en agua, como proteínas, aminoácidos y péptidos, se unen a restos que tienen carga opuesta formando enlaces iónicos con la fase estacionaria insoluble. [10] La fase estacionaria equilibrada consta de un grupo funcional ionizable donde las moléculas objetivo de una mezcla que se va a separar y cuantificar pueden unirse mientras pasan a través de la columna; se usa una fase estacionaria catiónica para separar aniones y una fase estacionaria aniónica para cationes separados. La cromatografía de intercambio catiónico se usa cuando las moléculas que se desean separar son cationes y la cromatografía de intercambio aniónico se usa para separar aniones. [11] Las moléculas unidas luego se pueden eluir y recolectar usando un eluyente que contiene aniones y cationes haciendo pasar una mayor concentración de iones a través de la columna o cambiando el pH de la columna.
Una de las principales ventajas del uso de la cromatografía iónica es que en la separación solo interviene una interacción, a diferencia de otras técnicas de separación; por lo tanto, la cromatografía iónica puede tener una mayor tolerancia a la matriz. Otra ventaja del intercambio iónico es la previsibilidad de los patrones de elución (basados en la presencia del grupo ionizable). [12] Por ejemplo, cuando se utiliza la cromatografía de intercambio catiónico, ciertos cationes eluirán primero y otros después. Siempre se mantiene un saldo de carga local. Sin embargo, también existen desventajas al realizar la cromatografía de intercambio iónico, como la evolución constante de la técnica que conduce a la inconsistencia de una columna a otra. [13] Una limitación importante de esta técnica de purificación es que se limita a grupos ionizables. [6]
La cromatografía iónica ha avanzado gracias a la acumulación de conocimientos a lo largo de muchos años. A partir de 1947, Spedding y Powell utilizaron la cromatografía de intercambio iónico por desplazamiento para la separación de tierras raras. Además, mostraron la separación por intercambio iónico de los isótopos 14N y 15N en amoníaco. A principios de la década de 1950, Kraus y Nelson demostraron el uso de muchos métodos analíticos para iones metálicos dependiendo de la separación de sus complejos de cloruro, fluoruro, nitrato o sulfato mediante cromatografía de aniones. Entre 1960 y 1980 se introdujo progresivamente la detección automática en línea, así como nuevos métodos cromatográficos para la separación de iones metálicos. Un método innovador desarrollado por Small, Stevens y Bauman en Dow Chemical Co. permitió la creación de la cromatografía iónica moderna. Los aniones y cationes ahora podrían separarse eficientemente mediante un sistema de detección de conductividad suprimida. En 1979, Gjerde et al. introdujeron un método para la cromatografía aniónica con detección de conductividad no suprimida. Le siguió, en 1980, un método similar para la cromatografía catiónica. [14]
Como resultado, comenzó un período de competencia extrema dentro del mercado de circuitos integrados, con partidarios de la detección de conductividad tanto suprimida como no suprimida . Esta competencia condujo a un rápido crecimiento de nuevas formas y a la rápida evolución de la CI. [15] Un desafío que debe superarse en el futuro desarrollo de CI es la preparación de columnas monolíticas de intercambio iónico altamente eficientes y superar este desafío sería de gran importancia para el desarrollo de CI. [dieciséis]
El auge de la cromatografía de intercambio iónico comenzó principalmente entre 1935 y 1950 durante la Segunda Guerra Mundial y fue a través del " proyecto Manhattan " que las aplicaciones y la CI se ampliaron significativamente. La cromatografía iónica fue introducida originalmente por dos investigadores ingleses, el agrícola Sir Thompson y el químico JT Way. Los trabajos de Thompson y Way implicaron la acción de sales fertilizantes solubles en agua, sulfato de amonio y cloruro de potasio. Estas sales no se podían extraer fácilmente del suelo debido a la lluvia. Realizaron métodos iónicos para tratar arcillas con sales, lo que resultó en la extracción de amoníaco además de la liberación de calcio. [17] [ ¿ fuente poco confiable? ] Fue en los años cincuenta y sesenta cuando se desarrollaron modelos teóricos para el CI para una mayor comprensión y no fue hasta los años setenta que se utilizaron detectores continuos, allanando el camino para el desarrollo de la cromatografía de baja presión a la de alto rendimiento. No fue hasta 1975 que se estableció "cromatografía iónica" como nombre en referencia a las técnicas, y posteriormente se utilizó como nombre con fines de marketing. Hoy en día, la CI es importante para investigar sistemas acuosos, como el agua potable. Es un método popular para analizar elementos o complejos aniónicos que ayudan a resolver problemas ambientalmente relevantes. Asimismo, también tiene grandes usos en la industria de los semiconductores . [18]
Debido a las abundantes columnas de separación, sistemas de elución y detectores disponibles, la cromatografía se ha convertido en el método principal para el análisis de iones. [19]
Cuando se desarrolló inicialmente esta técnica, se utilizaba principalmente para el tratamiento del agua. Desde 1935, la cromatografía de intercambio iónico se manifestó rápidamente como una de las técnicas más utilizadas, y sus principios a menudo se aplican a la mayoría de los campos de la química, incluidas la destilación, la adsorción y la filtración. [20]
La cromatografía de intercambio iónico separa las moléculas según sus respectivos grupos cargados. La cromatografía de intercambio iónico retiene las moléculas del analito en la columna basándose en interacciones culombicas (iónicas). La matriz de cromatografía de intercambio iónico consta de iones cargados positiva y negativamente. [21] Esencialmente, las moléculas experimentan interacciones electrostáticas con cargas opuestas en la matriz de fase estacionaria. La fase estacionaria consta de una matriz inmóvil que contiene grupos funcionales o ligandos ionizables cargados . [22] La superficie de la fase estacionaria muestra grupos funcionales iónicos (RX) que interactúan con iones analitos de carga opuesta. Para lograr la electroneutralidad, estas cargas inmovilizadas se acoplan con contraiones intercambiables en la solución. Las moléculas ionizables que deben purificarse compiten con estos contraiones intercambiables para unirse a las cargas inmovilizadas en la fase estacionaria. Estas moléculas ionizables se retienen o eluyen según su carga. Inicialmente, las moléculas que no se unen o se unen débilmente a la fase estacionaria son las primeras en eliminarse por lavado. Se necesitan condiciones alteradas para la elución de las moléculas que se unen a la fase estacionaria. Se puede aumentar la concentración de los contraiones intercambiables, que compiten con las moléculas por la unión, o se puede cambiar el pH para afectar la carga iónica del eluyente o del soluto. Un cambio de pH afecta la carga de determinadas moléculas y, por tanto, altera su unión. Cuando se reduce la carga neta de las moléculas del soluto, estas comienzan a eluir. De esta manera, dichos ajustes pueden usarse para liberar las proteínas de interés. Además, la concentración de contraiones se puede variar gradualmente para afectar la retención de las moléculas ionizadas y así separarlas. Este tipo de elución se llama elución en gradiente. Por otro lado, se puede utilizar la elución por etapas, en la que la concentración de contraiones se varía en etapas. [5] Este tipo de cromatografía se subdivide en cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de intercambio aniónico . Las moléculas cargadas positivamente se unen a las resinas de intercambio catiónico, mientras que las moléculas cargadas negativamente se unen a las resinas de intercambio aniónico. [23] El compuesto iónico formado por las especies catiónicas M+ y las especies aniónicas B− puede ser retenido por la fase estacionaria.
La cromatografía de intercambio catiónico retiene cationes cargados positivamente porque la fase estacionaria muestra un grupo funcional cargado negativamente:
La cromatografía de intercambio aniónico retiene aniones utilizando un grupo funcional cargado positivamente:
Tenga en cuenta que la fuerza iónica de C+ o A− en la fase móvil se puede ajustar para cambiar la posición de equilibrio y, por tanto, el tiempo de retención.
El cromatograma iónico muestra un cromatograma típico obtenido con una columna de intercambio aniónico.
Antes de poder iniciar la cromatografía de intercambio iónico, se debe equilibrar. La fase estacionaria debe equilibrarse según ciertos requisitos que dependen del experimento con el que esté trabajando. Una vez equilibrados, los iones cargados en la fase estacionaria se unirán a sus iones intercambiables con carga opuesta, como Cl - o Na + . A continuación, se debe elegir un tampón al que se pueda unir la proteína deseada. Después del equilibrio, es necesario lavar la columna. La fase de lavado ayudará a eliminar todas las impurezas que no se unen a la matriz mientras la proteína de interés permanece unida. Este tampón de muestra debe tener el mismo pH que el tampón utilizado para el equilibrio para ayudar a unir las proteínas deseadas. Las proteínas no cargadas se eluirán fuera de la columna a una velocidad similar a la del tampón que fluye a través de la columna sin retención. Una vez que la muestra se ha cargado en la columna y la columna se ha lavado con el tampón para eluir todas las proteínas no deseadas, la elución se lleva a cabo en condiciones específicas para eluir las proteínas deseadas que están unidas a la matriz. Las proteínas unidas se eluyen utilizando un gradiente de concentración de sal que aumenta linealmente. Al aumentar la fuerza iónica del tampón, los iones de sal competirán con las proteínas deseadas para unirse a grupos cargados en la superficie del medio. Esto hará que las proteínas deseadas se eluyan fuera de la columna. Las proteínas que tienen una carga neta baja serán eluidas primero a medida que aumenta la concentración de sal, lo que provoca que aumente la fuerza iónica. Las proteínas con carga neta alta necesitarán una fuerza iónica más alta para poder eluir fuera de la columna. [21]
Es posible realizar cromatografía de intercambio iónico en masa, sobre capas finas de medio como placas de vidrio o plástico recubiertas con una capa de la fase estacionaria deseada, o en columnas de cromatografía. La cromatografía en capa fina o la cromatografía en columna comparten similitudes en el sentido de que ambas actúan dentro de los mismos principios rectores; Hay un intercambio constante y frecuente de moléculas a medida que la fase móvil viaja a lo largo de la fase estacionaria. No es imperativo agregar la muestra en volúmenes diminutos ya que las condiciones predeterminadas para la columna de intercambio se han elegido de modo que haya una fuerte interacción entre las fases móvil y estacionaria. Además, el mecanismo del proceso de elución provocará una compartimentación de las diferentes moléculas en función de sus respectivas características químicas. Este fenómeno se debe a un aumento en las concentraciones de sal en o cerca de la parte superior de la columna, desplazando así las moléculas en esa posición, mientras que las moléculas unidas más abajo se liberan en un punto posterior cuando la concentración de sal más alta alcanza esa área. Estos principios son las razones por las que la cromatografía de intercambio iónico es un excelente candidato para los pasos cromatográficos iniciales en un procedimiento de purificación complejo, ya que puede producir rápidamente pequeños volúmenes de moléculas objetivo independientemente de un volumen inicial mayor. [6]
A menudo se utilizan dispositivos comparativamente simples para aplicar contraiones de gradiente creciente a una columna de cromatografía. Los contraiones como el cobre (II) se eligen con mayor frecuencia para separar eficazmente péptidos y aminoácidos mediante la formación de complejos. [24]
Se puede utilizar un dispositivo sencillo para crear un gradiente de sal. El tampón de elución se extrae constantemente de la cámara a la cámara de mezcla, alterando así su concentración de tampón. Generalmente, el tampón colocado en la cámara suele tener una concentración inicial alta, mientras que el tampón colocado en la cámara agitada suele tener una concentración baja. A medida que el tampón de alta concentración de la cámara izquierda se mezcla y se introduce en la columna, la concentración del tampón de la columna agitada aumenta gradualmente. La alteración de las formas de la cámara agitada, así como del amortiguador límite, permite la producción de gradientes de contraión cóncavos, lineales o convexos.
Para la fase estacionaria se utilizan una multitud de medios diferentes. Entre los grupos cargados inmovilizados más comunes utilizados se encuentran trimetilaminoetilo (TAM), trietilaminoetilo (TEAE), dietil-2-hidroxipropilaminoetilo (QAE), aminoetilo (AE), dietilaminoetilo (DEAE), sulfo (S), sulfometilo (SM), sulfopropilo ( SP), carboxi (C) y carboximetilo (CM). [5]
El empaquetamiento exitoso de la columna es un aspecto importante de la cromatografía iónica. La estabilidad y eficiencia de una columna final dependen de los métodos de empaquetamiento, el solvente utilizado y los factores que afectan las propiedades mecánicas de la columna. En contraste con los primeros métodos ineficientes de empaque en seco, el empaque en suspensión húmeda, en el que las partículas que están suspendidas en un solvente apropiado se entregan a una columna bajo presión, muestra una mejora significativa. Se pueden emplear tres enfoques diferentes para realizar el empaque de lodo húmedo: el método de densidad equilibrada (la densidad del solvente es aproximadamente la de las partículas de sílice porosas), el método de alta viscosidad (se usa un solvente de alta viscosidad) y el método de lodo de baja viscosidad (realizado con disolventes de baja viscosidad). [25]
El poliestireno se utiliza como medio para el intercambio iónico. Se elabora a partir de la polimerización de estireno con el uso de divinilbenceno y peróxido de benzoilo. Estos intercambiadores forman interacciones hidrofóbicas con proteínas que pueden ser irreversibles. Debido a esta propiedad, los intercambiadores de iones de poliestireno no son adecuados para la separación de proteínas. Por otro lado, se utilizan para la separación de moléculas pequeñas en la separación de aminoácidos y la eliminación de sal del agua. Para la separación de proteínas se pueden utilizar intercambiadores de iones de poliestireno con poros grandes, pero deben recubrirse con una sustancia hidrófila. [26]
El medio a base de celulosa se puede utilizar para la separación de moléculas grandes, ya que contienen poros grandes. La unión a proteínas en este medio es alta y tiene un carácter hidrofóbico bajo. DEAE es una matriz de intercambio aniónico que se produce a partir de un grupo lateral positivo de dietilaminoetilo unido a celulosa o Sephadex. [27]
El medio a base de gel de agarosa también contiene poros grandes, pero su capacidad de sustitución es menor en comparación con los dextranos. La capacidad del medio para hincharse en líquido se basa en la reticulación de estas sustancias, el pH y las concentraciones de iones de los tampones utilizados. [26]
La incorporación de alta temperatura y presión permite un aumento significativo de la eficiencia de la cromatografía iónica, junto con una disminución del tiempo. La temperatura influye en la selectividad debido a sus efectos sobre las propiedades de retención. El factor de retención ( k = ( t R g − t M g )/( t M g − t text )) aumenta con la temperatura para los iones pequeños, y se observa la tendencia opuesta para los iones más grandes. [28] [29]
A pesar de la selectividad iónica en diferentes medios, se están realizando más investigaciones para realizar cromatografía de intercambio iónico en el rango de 40 a 175 °C. [30]
Se puede elegir un disolvente apropiado basándose en observaciones de cómo se comportan las partículas de la columna en un disolvente. Usando un microscopio óptico, se puede distinguir fácilmente un estado disperso deseable de suspensión de partículas agregadas. [25]
Un intercambiador de iones "fuerte" no perderá la carga de su matriz una vez que la columna esté equilibrada y, por lo tanto, se puede utilizar una amplia gama de tampones de pH. Los intercambiadores de iones "débiles" tienen un rango de valores de pH en los que mantendrán su carga. Si el pH del tampón utilizado para una columna de intercambio iónico débil se sale del rango de capacidad de la matriz, la columna perderá su distribución de carga y es posible que se pierda la molécula de interés. [31] A pesar del rango de pH más pequeño de los intercambiadores de iones débiles, a menudo se usan en lugar de los intercambiadores de iones fuertes debido a que tienen una mayor especificidad. En algunos experimentos, los tiempos de retención de los intercambiadores de iones débiles son lo suficientemente largos para obtener los datos deseados con una alta especificidad. [32]
Las resinas (a menudo denominadas "perlas") de las columnas de intercambio iónico pueden incluir grupos funcionales como ácidos débiles/fuertes y bases débiles/fuertes. También existen columnas especiales que tienen resinas con grupos funcionales anfóteros que pueden intercambiar tanto cationes como aniones. [33] Algunos ejemplos de grupos funcionales de resinas de intercambio iónico fuertes son el catión de amonio cuaternario (Q), que es un intercambiador aniónico, y el ácido sulfónico (S, -SO 2 OH), que es un intercambiador de cationes. [34] Estos tipos de intercambiadores pueden mantener su densidad de carga en un rango de pH de 0 a 14. Ejemplos de grupos funcionales de resinas de intercambio iónico débiles incluyen dietilaminoetilo (DEAE, -C 2 H 4 N (CH 2 H 5 ) 2 ), que es un intercambiador de aniones, y carboximetilo (CM, -CH 2 -COOH), [35] que es un intercambiador de cationes. Estos dos tipos de intercambiadores pueden mantener la densidad de carga de sus columnas en un rango de pH de 5 a 9. [ cita necesaria ]
En la cromatografía iónica, la interacción de los iones del soluto y la fase estacionaria en función de sus cargas determina qué iones se unirán y en qué grado. Cuando la fase estacionaria presenta grupos positivos que atraen aniones, se denomina intercambiador aniónico; cuando hay grupos negativos en la fase estacionaria, se atraen los cationes y es un intercambiador de cationes. [36] La atracción entre los iones y la fase estacionaria también depende de la resina, partículas orgánicas utilizadas como intercambiadores de iones.
Cada resina presenta una selectividad relativa que varía según los iones solutos presentes que competirán para unirse al grupo de resina en la fase estacionaria. El coeficiente de selectividad, el equivalente a la constante de equilibrio, se determina mediante una relación de las concentraciones entre la resina y cada ion; sin embargo, la tendencia general es que los intercambiadores de iones prefieren unirse al ion con mayor carga, radio hidratado más pequeño y mayor polarizabilidad, o la capacidad de la nube de electrones de un ion de ser interrumpida por otras cargas. [37] A pesar de esta selectividad, cantidades excesivas de un ion con una selectividad más baja introducidas en la columna harían que el ion menor se una más a la fase estacionaria, ya que el coeficiente de selectividad permite fluctuaciones en la reacción de unión que tiene lugar durante la cromatografía de intercambio iónico.
La siguiente tabla muestra los intercambiadores de iones comúnmente utilizados [38]
Se introduce una muestra, ya sea manualmente o con un muestreador automático , en un bucle de muestra de volumen conocido. Una solución acuosa tamponada conocida como fase móvil transporta la muestra desde el bucle a una columna que contiene algún tipo de material de fase estacionaria. Normalmente se trata de una matriz de resina o gel que consta de perlas de agarosa o celulosa con grupos funcionales cargados unidos covalentemente . Es necesario equilibrar la fase estacionaria para obtener la carga deseada de la columna. Si la columna no está equilibrada adecuadamente, es posible que la molécula deseada no se una fuertemente a la columna. Los analitos objetivo (aniones o cationes) se retienen en la fase estacionaria, pero pueden eluirse aumentando la concentración de una especie con carga similar que desplaza los iones del analito de la fase estacionaria. Por ejemplo, en la cromatografía de intercambio catiónico, el analito cargado positivamente puede desplazarse añadiendo iones de sodio cargados positivamente. Luego, los analitos de interés deben detectarse por algún medio, normalmente mediante conductividad o absorbancia de luz UV/visible.
El control de un sistema IC generalmente requiere un sistema de datos de cromatografía (CDS). Además de los sistemas IC, algunos de estos CDS también pueden controlar la cromatografía de gases (GC) y HPLC.
Un tipo de cromatografía de intercambio iónico, el intercambio de membranas [39] [40] es un método de purificación relativamente nuevo diseñado para superar las limitaciones del uso de columnas llenas de perlas. Los dispositivos cromatográficos de membrana [41] [42] son baratos de producir en masa y desechables, a diferencia de otros dispositivos de cromatografía que requieren mantenimiento y tiempo para revalidar. Hay tres tipos de absorbentes de membrana que se utilizan normalmente para separar sustancias. Los tres tipos son de lámina plana, de fibra hueca y de flujo radial. El absorbente más común y el más adecuado para la cromatografía de membrana son las láminas planas múltiples porque tienen más volumen absorbente. Puede usarse para superar las limitaciones de la transferencia de masa [43] y la caída de presión, [44] lo que lo hace especialmente ventajoso para aislar y purificar virus, ADN plasmídico y otras macromoléculas grandes. La columna está repleta de membranas microporosas con poros internos que contienen restos adsorbentes que pueden unirse a la proteína objetivo. Las membranas adsorbentes están disponibles en una variedad de geometrías y químicas que permiten su uso para purificación y también para fraccionamiento, concentración y clarificación con una eficiencia 10 veces mayor que la del uso de perlas. [45] Las membranas se pueden preparar mediante el aislamiento de la propia membrana, donde las membranas se cortan en cuadrados y se inmovilizan. Un método más reciente implicó el uso de células vivas que se unen a una membrana de soporte y se utilizan para la identificación y clarificación de moléculas de señalización. [46]
La cromatografía de intercambio iónico se puede utilizar para separar proteínas porque contienen grupos funcionales cargados. Los iones de interés (en este caso proteínas cargadas) se intercambian por otros iones (normalmente H + ) sobre un soporte sólido cargado. Los solutos suelen estar en fase líquida, que tiende a ser agua. Tomemos, por ejemplo, las proteínas en agua, que serían una fase líquida que pasa a través de una columna. La columna se conoce comúnmente como fase sólida ya que está llena de partículas sintéticas porosas que tienen una carga particular. Estas partículas porosas también se denominan perlas, pueden estar aminadas (conteniendo grupos amino) o tener iones metálicos para tener carga. La columna se puede preparar utilizando polímeros porosos; para macromoléculas con una masa superior a 100.000 Da, el tamaño óptimo de la partícula porosa es aproximadamente 1 μm 2 . Esto se debe a que la lenta difusión de los solutos dentro de los poros no restringe la calidad de la separación. [47] Las perlas que contienen grupos cargados positivamente, que atraen a las proteínas cargadas negativamente, se denominan comúnmente resinas de intercambio aniónico. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales cargadas negativamente a pH 7 (pH del agua) son el glutamato y el aspartato. Las perlas que están cargadas negativamente se llaman resinas de intercambio catiónico, ya que atraerán proteínas cargadas positivamente. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales cargadas positivamente a pH 7 son lisina, histidina y arginina. [48]
El punto isoeléctrico es el pH al que un compuesto (en este caso una proteína) no tiene carga neta. El punto isoeléctrico o PI de una proteína se puede determinar utilizando el pKa de las cadenas laterales; si el amino (cadena positiva) es capaz de cancelar la cadena carboxilo (negativa), la proteína estaría en su PI. Usar tampones en lugar de agua para proteínas que no tienen carga a pH 7 es una buena idea, ya que permite la manipulación del pH para alterar las interacciones iónicas entre las proteínas y las perlas. [49] Las cadenas laterales débilmente ácidas o básicas pueden tener una carga si el pH es lo suficientemente alto o bajo, respectivamente. La separación se puede lograr basándose en el punto isoeléctrico natural de la proteína. Alternativamente, se puede agregar genéticamente una etiqueta peptídica a la proteína para darle a la proteína un punto isoeléctrico alejado de la mayoría de las proteínas naturales (p. ej., 6 argininas para unirse a una resina de intercambio catiónico o 6 glutamatos para unirse a una resina de intercambio aniónico como DEAE -Sefarosa).
La elución al aumentar la fuerza iónica de la fase móvil es más sutil. Funciona porque los iones de la fase móvil interactúan con los iones inmovilizados en la fase estacionaria, "protegiendo" así la fase estacionaria de la proteína y permitiendo que la proteína eluya.
La elución de columnas de intercambio iónico puede ser sensible a los cambios de una sola carga : cromatoenfoque . La cromatografía de intercambio iónico también es útil en el aislamiento de conjuntos de proteínas multiméricas específicas, lo que permite la purificación de complejos específicos según el número y la posición de las etiquetas peptídicas cargadas. [50] [51]
En la cromatografía de intercambio iónico, el efecto Gibbs-Donnan se observa cuando el pH del tampón aplicado y el intercambiador iónico difieren, incluso hasta una unidad de pH. Por ejemplo, en las columnas de intercambio aniónico, los intercambiadores iónicos eliminan los protones, por lo que el pH del tampón cerca de la columna es más alto que el del resto del disolvente. [52] Como resultado, un experimentador debe tener cuidado de que las proteínas de interés sean estables y estén cargadas adecuadamente en el pH "real".
Este efecto se debe a que dos partículas cargadas de manera similar, una de la resina y otra de la solución, no se distribuyen adecuadamente entre los dos lados; hay una captación selectiva de un ion sobre otro. [53] [54] Por ejemplo, en una resina de poliestireno sulfonado, una resina de intercambio catiónico, el ion cloro de un tampón de ácido clorhídrico debe equilibrarse en la resina. Sin embargo, dado que la concentración de ácido sulfónico en la resina es alta, el hidrógeno del HCl no tiene tendencia a entrar en la columna. Esto, combinado con la necesidad de electroneutralidad, conduce a que entre una cantidad mínima de hidrógeno y cloro en la resina. [54]
Se puede observar un uso de la cromatografía iónica en la cromatografía de argentación . [ cita necesaria ] Por lo general, la plata y los compuestos que contienen enlaces acetilénicos y etilénicos tienen interacciones muy débiles. Este fenómeno ha sido ampliamente probado en compuestos de olefinas. Los complejos iónicos que forman las olefinas con iones de plata son débiles y se basan en la superposición de los orbitales pi, sigma y d y los electrones disponibles, por lo que no causan cambios reales en el doble enlace. Este comportamiento se manipuló para separar lípidos, principalmente ácidos grasos, de mezclas en fracciones con diferente número de dobles enlaces utilizando iones de plata. Las resinas iónicas se impregnaron con iones de plata, que luego se expusieron a varios ácidos (ácido silícico) para eluir ácidos grasos de diferentes características.
Se pueden obtener límites de detección tan bajos como 1 μM para iones de metales alcalinos. [55] Puede usarse para medir HbA1c , porfirina y con purificación de agua . Las resinas de intercambio iónico (IER) se han utilizado ampliamente, especialmente en medicamentos, debido a su alta capacidad y al sencillo sistema de proceso de separación. Uno de los usos sintéticos es el uso de resinas de intercambio iónico para diálisis renal. Este método se utiliza para separar los elementos sanguíneos mediante el uso de un riñón artificial con membrana de celulosa. [56]
Otra aplicación clínica de la cromatografía iónica es la técnica de cromatografía rápida de intercambio aniónico utilizada para separar las isoenzimas de creatina quinasa (CK) del suero y tejido humanos obtenidos del material de autopsia (se utilizaron principalmente tejidos ricos en CK, como el músculo cardíaco y el cerebro). [ cita necesaria ] Estas isoenzimas incluyen MM, MB y BB, que llevan a cabo la misma función dadas diferentes secuencias de aminoácidos. Las funciones de estas isoenzimas son convertir la creatina, utilizando ATP, en fosfocreatina expulsando ADP. Se llenaron minicolumnas con DEAE-Sephadex A-50 y se eluyeron adicionalmente con tampón tris de cloruro sódico a diversas concentraciones (cada concentración se eligió ventajosamente para manipular la elución). Se insertó extracto de tejido humano en columnas para su separación. Se analizaron todas las fracciones para ver la actividad total de CK y se encontró que cada fuente de isoenzimas de CK tenía isoenzimas características en su interior. En primer lugar, se eluyó CK-MM, luego CK-MB, seguido de CK-BB. Por lo tanto, las isoenzimas encontradas en cada muestra podrían usarse para identificar la fuente, ya que eran específicas de tejido.
Utilizando la información de los resultados, se pudo hacer una correlación entre el diagnóstico de los pacientes y el tipo de isoenzimas de CK que se encuentran en actividad más abundante. Según el hallazgo, alrededor de 35 de 71 pacientes estudiados sufrieron un ataque cardíaco (infarto de miocardio) y también contenían una cantidad abundante de las isoenzimas CK-MM y CK-MB. Los hallazgos muestran además que en muchos otros diagnósticos, como insuficiencia renal, enfermedad cerebrovascular y enfermedad pulmonar, solo se encontró que tenían la isoenzima CK-MM y ninguna otra isoenzima. Los resultados de este estudio indican correlaciones entre diversas enfermedades y las isoenzimas de CK encontradas, lo que confirma resultados de pruebas anteriores utilizando diversas técnicas. Los estudios sobre la CK-MB encontrada en víctimas de ataques cardíacos se han ampliado desde este estudio y la aplicación de la cromatografía iónica.
Desde 1975 la cromatografía iónica se ha utilizado ampliamente en muchas ramas de la industria. Las principales ventajas beneficiosas son la confiabilidad, muy buena exactitud y precisión, alta selectividad, alta velocidad, alta eficiencia de separación y bajo costo de consumibles. El avance más significativo relacionado con la cromatografía iónica son los nuevos métodos de preparación de muestras; mejorar la velocidad y selectividad de la separación de analitos; reducción de los límites de detección y de los límites de cuantificación; ampliar el alcance de las aplicaciones; desarrollo de nuevos métodos estándar; miniaturización y ampliación del alcance del análisis de un nuevo grupo de sustancias. Permite realizar pruebas cuantitativas de electrolitos y aditivos patentados de baños de galvanoplastia . [57] Es un avance de las pruebas cualitativas de células del casco o pruebas UV menos precisas. Se pueden medir iones, catalizadores, abrillantadores y aceleradores. [57] La cromatografía de intercambio iónico se ha convertido gradualmente en una técnica universal y ampliamente conocida para la detección de especies tanto aniónicas como catiónicas. Se han desarrollado o están en desarrollo aplicaciones para tales fines para una variedad de campos de interés y, en particular, la industria farmacéutica. El uso de la cromatografía de intercambio iónico en productos farmacéuticos ha aumentado en los últimos años y, en 2006, se añadió oficialmente un capítulo sobre cromatografía de intercambio iónico al Formulario Nacional de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP-NF). Además, en la publicación de la USP-NF en 2009, la Farmacopea de los Estados Unidos puso a disposición varios análisis de cromatografía iónica utilizando dos técnicas: detección de conductividad y detección amperométrica de pulso . La mayoría de estas aplicaciones se utilizan principalmente para medir y analizar límites residuales en productos farmacéuticos, incluida la detección de límites de oxalato, yoduro, sulfato, sulfamato, fosfato, así como varios electrolitos, incluidos potasio y sodio. En total, la edición de 2009 de la USP-NF publicó oficialmente veintiocho métodos de detección para el análisis de compuestos activos, o componentes de compuestos activos, mediante detección de conductividad o detección amperométrica de pulso. [58]
Ha habido un interés creciente en la aplicación de la CI en el análisis de fármacos. IC se utiliza en diferentes aspectos del desarrollo de productos y pruebas de control de calidad. Por ejemplo, el IC se utiliza para mejorar la estabilidad y las propiedades de solubilidad de las moléculas de fármacos activos farmacéuticos, así como para detectar sistemas que tienen una mayor tolerancia a los disolventes orgánicos. IC se ha utilizado para la determinación de analitos como parte de una prueba de disolución. Por ejemplo, las pruebas de disolución de calcio han demostrado que otros iones presentes en el medio pueden disolverse bien entre sí y también a partir del ión calcio. Por lo tanto, la CI se ha empleado en medicamentos en forma de tabletas y cápsulas para determinar la cantidad de fármaco que se disuelve con el tiempo. [59] La CI también se utiliza ampliamente para la detección y cuantificación de excipientes o ingredientes inactivos utilizados en formulaciones farmacéuticas. La detección de azúcar y alcohol de azúcar en dichas formulaciones mediante IC se ha realizado debido a que estos grupos polares se resuelven en la columna de iones. La metodología IC también se estableció en el análisis de impurezas en sustancias y productos farmacéuticos. Se evalúan las impurezas o cualquier componente que no forme parte de la entidad química del fármaco y brindan información sobre las cantidades máximas y mínimas de fármaco que se deben administrar a un paciente por día. [60]
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