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Inmunoprecipitación reticulada

El entrecruzamiento y la inmunoprecipitación ( CLIP, o CLIP-seq ) es un método utilizado en biología molecular que combina el entrecruzamiento UV con la inmunoprecipitación para identificar los sitios de unión del ARN de las proteínas en una escala de todo el transcriptoma, aumentando así nuestra comprensión de las reacciones postranscripcionales. redes regulatorias. [1] [2] [3] CLIP se puede utilizar con anticuerpos contra proteínas endógenas o con etiquetas peptídicas comunes (incluidas FLAG, V5, HA y otras) o purificación por afinidad, lo que permite la posibilidad de perfilar organismos modelo o RBP. por lo demás carecen de anticuerpos adecuados. [4]

Flujo de trabajo

Principio básico de CLIP

CLIP comienza con el entrecruzamiento in vivo de complejos de ARN-proteína utilizando luz ultravioleta (UV). Tras la exposición a los rayos UV, se forman enlaces covalentes entre proteínas y ácidos nucleicos que están muy próximos (del orden de Angstroms de separación). [5] Luego, las células entrecruzadas se lisan, el ARN se fragmenta y la proteína de interés se aísla mediante inmunoprecipitación. Para permitir el cebado de la transcripción inversa, se ligan adaptadores de ARN a los extremos 3' y se marcan los fragmentos de ARN para permitir el análisis de los complejos de ARN-proteína después de que se hayan separado del ARN libre mediante electroforesis en gel y transferencia de membrana. Luego se realiza la digestión con proteinasa K para eliminar la proteína del ARN entrecruzado, lo que deja unos pocos aminoácidos en el sitio de entrecruzamiento. Esto a menudo conduce al truncamiento de los ADNc en el nucleótido reticulado, lo que se aprovecha en variantes como iCLIP para aumentar la resolución del método. [6] Luego se sintetiza el ADNc mediante RT-PCR, seguido de una secuenciación de alto rendimiento seguida de un mapeo de las lecturas en el transcriptoma y otros análisis computacionales para estudiar los sitios de interacción. [2]

Historia y aplicaciones

CLIP se llevó a cabo originalmente para estudiar las interacciones entre la proteína de unión a ARN específica de neuronas y los factores de empalme NOVA1 y NOVA2 en el cerebro de ratón , identificando sitios de unión a ARN que contenían los motivos de unión a Nova esperados. La secuenciación de la biblioteca de ADNc identificó muchas posiciones cercanas a exones alternativos, y se descubrió que varios de los cuales requerían Nova1/2 para sus patrones de empalme específicos del cerebro. [1] En 2008, CLIP se combinó con secuenciación de alto rendimiento (denominada "HITS-CLIP") para generar mapas de interacción proteína-ARN de todo el genoma para Nova; [7] desde entonces se han estudiado otras proteínas de unión a ARN con CLIP, incluida PTBP1, [8] RbFox2 (donde se la denominaba "CLIP-seq"), [9] SFRS1, [10] Argonaute, [11] [12] [13] hnRNP C, [6] la proteína de retraso mental FMRP de X frágil, [14] [15] Ptbp2 (en el cerebro del ratón), [16] Mbnl2, [17] las proteínas nElavl ( las proteínas Hu específicas de neuronas), [18] y se ha aplicado a proteínas de unión a ARN de todos los reinos de la vida, incluidos los procariotas. [19] El análisis CLIP de la proteína de unión a ARN Argonaute condujo a la identificación de objetivos de microARN [20] mediante la decodificación de mapas de interacción microARN -ARNm y proteína-ARN en el cerebro del ratón [11] [21] y posteriormente en levaduras en ciernes ( Saccharomyces cerevisiae ) , [22] Caenorhabditis elegans , [23] células madre embrionarias [24] y células de cultivo de tejidos. [25]

Métodos

CLIP DE HITS

CLIP DE HITS [26] [27]

HITS-CLIP combina reticulación UVe inmunoprecipitación con secuenciación de alto rendimiento para identificar sitios de unión de proteínas de unión a ARN. [5] HITS-CLIP también introdujo la adición de códigos de barras de dinucleótidos a los cebadores, proporcionando la capacidad de secuenciar y luego desconvolucionar múltiples experimentos simultáneamente. [7] Con el análisis de sitios de mutación inducida por entrecruzamiento (CIMS) a altas profundidades de secuenciación , los sitios de entrecruzamiento se pueden diferenciar de otras fuentes de variación de secuencia. [28]

PAR-CLIP

PAR-CLIP [26] [27]

PAR-CLIP (entrecruzamiento e inmunoprecipitación mejorada con ribonucleósidos fotoactivables) también se utiliza para identificar los sitios de unión de proteínas celulares de unión a ARN (RBP) y complejos de ribonucleoproteínas que contienen microARN (miRNP). [25] El método se basa en la incorporación de análogos de ribonucleósidos fotorreactivos, como 4-tiouridina (4-SU) y 6-tioguanosina (6-SG) en transcripciones de ARN nacientes por parte de células vivas. La irradiación de las células con luz ultravioleta de 365 nm induce un entrecruzamiento eficiente de los ARN celulares fotorreactivos marcados con nucleósidos con las RBP que interactúan. A la inmunoprecipitación del RBP de interés le sigue el aislamiento del ARN entrecruzado y coinmunoprecipitado. El ARN aislado se convierte en una biblioteca de ADNc y se secuencia en profundidad utilizando tecnología de secuenciación de alto rendimiento . La reticulación de los análogos 4-SU y 6-SG da como resultado transiciones de timidina a citidina y de guanosina a adenosina, respectivamente. Como resultado, PAR-CLIP puede identificar ubicaciones de sitios de unión con alta precisión.

Sin embargo, PAR-CLIP se limita principalmente a células cultivadas y la citotoxicidad de los nucleósidos es motivo de preocupación; [2] se ha informado que el 4-SU inhibe la síntesis de ARN ribosómico, induce una respuesta de estrés nucleolar y reduce la proliferación celular. [29] PAR-CLIP se ha empleado para determinar los sitios de unión de todo el transcriptoma de varias RBP conocidas y complejos de ribonucleoproteínas que contienen microARN en alta resolución. Esto incluye el miARN dirigido a las proteínas AGO y TNRC6. [21]

iCLIP

CLIP [26] [27]

iCLIP (inmunoprecipitación y entrecruzamiento con resolución de nucleótidos individuales) es una variante de CLIP que permitió la amplificación de ADNc truncados, que se producen cuando la transcripción inversa se detiene prematuramente en el sitio de entrecruzamiento. [6] Otros enfoques para identificar sitios de entrecruzamiento de proteína-ARN incluyen el análisis mutacional de ADNc leídos, como las transiciones de nucleótidos en PAR-CLIP , [25] o errores raros introducidos por la transcriptasa inversa cuando lee los sitios de entrecruzamiento en HITS estándar. -Métodos CLIP , denominados análisis del sitio de mutación inducida por reticulación (CIMS). [30]

iCLIP también agregó una secuencia aleatoria (identificador molecular único, UMI ) junto con códigos de barras experimentales al cebador utilizado para la transcripción inversa, codificando así ADNc únicos para minimizar cualquier error o sesgo cuantitativo de la PCR y mejorando así la cuantificación de los eventos de unión. Permitir la amplificación de ADNc truncados condujo a la identificación de los sitios de interacciones ARN-proteína en alta resolución mediante el análisis de la posición inicial de los ADNc truncados, así como su cuantificación precisa utilizando UMI con un software llamado "iCount". Estas innovaciones de iCLIP fueron adoptadas por variantes posteriores de CLIP como eCLIP e irCLIP. [4] Otra modificación de iCLIP, miCLIP, identifica sitios de ARN metilados con el uso de una enzima mutante o un anticuerpo específico de la modificación. [31] [32] [2] La naturaleza cuantitativa de iCLIP permitió la comparación entre muestras al nivel de ARN completo, [33] o estudiar la unión competitiva de múltiples proteínas de unión a ARN [34] o cambios sutiles en la unión de un mutante proteína al nivel de los picos de unión. [35]

eCLIP

eCLIP (reticulación cruzada e inmunoprecipitación mejorada seguida de secuenciación de alto rendimiento) también se utiliza para mapear sitios de unión de RBP en todo el transcriptoma de ARN. [36] eCLIP fue diseñado para mejorar iCLIP al aumentar la eficiencia en la conversión de fragmentos de ARN purificados en una biblioteca de ADNc. En su publicación, se informó que eCLIP aumentaba dicha eficiencia en >1000 veces, lo que no solo disminuye la secuenciación desperdiciada de moléculas duplicadas de PCR, sino que también disminuye drásticamente los fallos experimentales durante el procedimiento CLIP. Además, la amplificación en eCLIP ahora es comparable a RNA-seq, lo que permite una normalización cuantitativa rigurosa frente a controles de entrada emparejados (para eliminar el fondo en ARN ribosómico y otros ARN altamente abundantes), así como una comparación cuantitativa entre picos y muestras, lo que permite detectar alelos. -unión específica o unión diferencial de ARN entre condiciones.
Como en otros métodos CLIP, eCLIP se basa en interacciones RBP-ARN unidas covalentemente mediante reticulación UV de células vivas. Luego se lisan las células y se fragmenta el ARN mediante un tratamiento limitado con ARNasa. Luego se inmunoprecipita una RBP específica (y su ARN unido) utilizando un anticuerpo que reconoce específicamente la RBP objetivo. Después de la ligación de un adaptador de ARN 3', el material inmunoprecipitado (así como una muestra de entrada emparejada) se procesa en geles de proteínas desnaturalizantes y se transfiere a membranas de nitrocelulosa. Se corta de la membrana una región desde el tamaño de la proteína hasta 75 kDa y se trata con proteinasa K para liberar ARN. Después de la limpieza, el ARN se transcribe inversamente a ssDNA, cuando se liga un segundo adaptador. Al ligar el segundo adaptador a los ADNc, eCLIP puede identificar ADNc truncados, similar a iCLIP, y así estudiar los sitios de interacción ARN-proteína con alta resolución. Luego se utiliza la amplificación por PCR para obtener material suficiente para la secuenciación de alto rendimiento. eCLIP también se puede utilizar para identificar objetivos de miARN y perfilar modificaciones de ARN como m6A.
Se han producido conjuntos de datos eCLIP para más de 150 RBP con anticuerpos validados disponibles comercialmente. [37]

Otros métodos CLIP

sCLIP (CLIP simple) es una técnica que requiere menores cantidades de ARN de entrada y omite el radiomarcaje del ARN inmunoprecipitado. El método se basa en la amplificación lineal del ARN inmunoprecipitado y, por lo tanto, mejora la complejidad de la biblioteca de secuenciación a pesar de reducir significativamente la cantidad de material de entrada y omitir varios pasos de purificación. Además, permite una visualización sin radiomarcadores del ARN inmunoprecipitado mediante el uso de una técnica de etiquetado basada en biotina altamente sensible. Junto con una plataforma bioinformática, este método está diseñado para proporcionar conocimientos profundos sobre los interactomas ARN-proteína en la ciencia biomédica, donde la cantidad de material de partida suele ser limitada (es decir, en el caso de muestras clínicas valiosas). [38] También se han desarrollado variantes adicionales de iCLIP que conservan la resolución de nucleótidos individuales pero difieren en uno o más pasos del método iCLIP original. Estos incluyen iCLIP2, irCLIP, iiCLIP e iCLIP1.5, por nombrar algunos.

Como modificación de CLIP, los sitios de ARN metilados se identificaron con el uso de una enzima mutante o un anticuerpo específico de modificación con los métodos denominados miCLIP o m6A-CLIP. [31] [32] [39] [2]

Ventajas y limitaciones

Ventajas

Las proteínas de unión a ARN son frecuentemente componentes de complejos multiproteicos, y los ARN de varios genes están presentes en las células en un rango de abundancia, por lo que es común que se puedan aislar los ARN unidos a proteínas copurificadas o que se adhieran no específicamente a perlas. al inmunoprecipitar una proteína específica. Se ha demostrado que la especificidad de los datos obtenidos utilizando métodos tempranos de inmunoprecipitación como RIP depende de las condiciones de reacción del experimento, como las concentraciones de proteínas y las condiciones iónicas, y la reasociación de proteínas de unión a ARN después de la lisis celular podría conducir a la detección de interacciones artificiales. . [40] Se han utilizado métodos de entrecruzamiento con formaldehído para preservar las interacciones entre ARN y proteínas, pero también generan entrecruzamientos entre proteínas. Al emplear un entrecruzamiento UV que es específico para los contactos directos proteína-ARN, CLIP evita los entrecruzamientos proteína-proteína y garantiza una alta especificidad, al mismo tiempo que obtiene información posicional en los sitios de interacciones proteína-ARN.

Dado que el entrecruzamiento por luz ultravioleta crea un enlace covalente, los fragmentos de ARN entrecruzados retienen un péptido corto después de la digestión con proteinasa K, que puede aprovecharse para identificar el sitio de entrecruzamiento. La transcripción inversa con mayor frecuencia se trunca en los sitios de entrecruzamiento, creando ADNc truncados que son explotados por iCLIP, mientras que los ADNc de lectura directa a menudo contienen mutaciones en el sitio de entrecruzamiento (consulte HITS-CLIP y PAR-CLIP). [2]

Limitaciones

Resumen de CLIP [26] [28] [27]

Todos los protocolos de generación de bibliotecas CLIP requieren cantidades moderadas de células o tejido (50 a 100 mg), requieren numerosos pasos enzimáticos y análisis computacionales personalizados. [12] [41] Ciertos pasos son difíciles de optimizar y con frecuencia tienen baja eficiencia. Por ejemplo, la sobredigestión con RNasa puede disminuir el número de sitios de unión identificados y, por lo tanto, debe optimizarse. [27] La ​​eficiencia de entrecruzamiento también varía entre proteínas, [42] y se ha informado un sesgo de nucleótidos en el entrecruzamiento, [43] por ejemplo comparando sitios y motivos de entrecruzamiento enriquecidos cuando los complejos proteína-ARN se estudian in vivo en células vivas y en vitro , [44] aunque se están desarrollando métodos para minimizar ese sesgo en el descubrimiento de motivos enriquecidos. [45] Los objetivos de miARN predichos computacionalmente derivados de TargetScan son comparables a CLIP en la identificación de objetivos de miARN, lo que plantea dudas sobre su utilidad en relación con las predicciones existentes. [46] Debido a que los métodos CLIP se basan en la inmunoprecipitación, el ARN reticulado podría en algunos casos afectar las interacciones anticuerpo-epítopo. Finalmente, se han observado diferencias significativas. Por lo tanto, los resultados sin procesar de CLIP requieren análisis computacionales adicionales para investigar a fondo las interacciones del sitio de unión de ARN-proteína dentro de la célula.

Métodos similares

Otras lecturas

Referencias

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Fuentes