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Fusión de bicapa lipídica

Ilustración de la fusión de vesículas lipídicas que muestra dos resultados posibles: hemifusión y fusión completa. En la hemifusión, solo se mezclan las láminas de la bicapa externa. En la fusión completa, se mezclan tanto las láminas como el contenido interno.

En biología de membranas , la fusión es el proceso por el cual dos bicapas lipídicas inicialmente distintas fusionan sus núcleos hidrofóbicos , dando como resultado una estructura interconectada. Si esta fusión se produce completamente a través de ambas láminas de ambas bicapas, se forma un puente acuoso y los contenidos internos de las dos estructuras pueden mezclarse. Alternativamente, si solo una lámina de cada bicapa está involucrada en el proceso de fusión, se dice que las bicapas están hemifusionadas. En la hemifusión, los componentes lipídicos de la lámina externa de las dos bicapas pueden mezclarse, pero las láminas internas permanecen distintas. Los contenidos acuosos encerrados por cada bicapa también permanecen separados.

La fusión está involucrada en muchos procesos celulares, particularmente en eucariotas , ya que la célula eucariota está ampliamente subdividida por membranas de bicapa lipídica. La exocitosis , la fertilización de un óvulo por el espermatozoide y el transporte de productos de desecho al lisosoma son algunos de los muchos procesos eucariotas que dependen de alguna forma de fusión. La fusión también es un mecanismo importante para el transporte de lípidos desde su sitio de síntesis hasta la membrana donde se necesitan. Incluso la entrada de patógenos puede estar gobernada por la fusión, ya que muchos virus recubiertos con bicapa tienen proteínas de fusión dedicadas para ingresar a la célula huésped.

Mecanismo lipídico

Hay cuatro pasos fundamentales en el proceso de fusión, aunque cada uno de ellos representa en realidad una secuencia compleja de acontecimientos. [1] En primer lugar, las membranas implicadas deben agregarse, aproximándose entre sí a unos pocos nanómetros. En segundo lugar, las dos bicapas deben entrar en contacto muy cercano (a unos pocos angstroms). Para lograr este contacto cercano, las dos superficies deben deshidratarse al menos parcialmente, ya que el agua superficial ligada normalmente presente hace que las bicapas se repelan fuertemente a esta distancia. En tercer lugar, debe desarrollarse una desestabilización en un punto entre las dos bicapas, lo que induce una reorganización muy localizada de las dos bicapas. Por último, a medida que este defecto puntual crece, los componentes de las dos bicapas se mezclan y difunden alejándose del sitio de contacto. Dependiendo de si se produce hemifusión o fusión completa, el contenido interno de las membranas también puede mezclarse en este punto.

Ilustración esquemática del proceso de fusión a través de la formación del tallo.

Los mecanismos exactos detrás de esta compleja secuencia de eventos aún son un tema de debate. Para simplificar el sistema y permitir un estudio más definitivo, se han realizado muchos experimentos in vitro con vesículas lipídicas sintéticas. Estos estudios han demostrado que los cationes divalentes juegan un papel crítico en el proceso de fusión al unirse a lípidos cargados negativamente como la fosfatidilserina , el fosfatidilglicerol y la cardiolipina . [2] Una función de estos iones en el proceso de fusión es proteger la carga negativa en la superficie de la bicapa, disminuyendo la repulsión electrostática y permitiendo que las membranas se acerquen entre sí. Sin embargo, claramente esta no es la única función, ya que existe una diferencia ampliamente documentada en la capacidad de Mg 2+ versus Ca 2+ para inducir la fusión. Aunque Mg 2+ inducirá una agregación extensa, no inducirá la fusión, mientras que Ca 2+ induce ambas. [3] Se ha propuesto que esta discrepancia se debe a una diferencia en el grado de deshidratación. Según esta teoría, los iones de calcio se unen con mayor fuerza a los lípidos cargados, pero con menor fuerza al agua. El desplazamiento resultante del calcio por el agua desestabiliza la interfaz lípido-agua y promueve el contacto íntimo entre bicapas. [4] Una hipótesis alternativa propuesta recientemente es que la unión del calcio induce una tensión lateral desestabilizadora . [5] Cualquiera que sea el mecanismo de fusión inducida por calcio, la interacción inicial es claramente electrostática, ya que los lípidos zwitteriónicos no son susceptibles a este efecto. [6] [7]

En el proceso de fusión, el grupo de cabeza lipídica no solo está involucrado en la densidad de carga, sino que también puede afectar la deshidratación y la nucleación defectuosa. Estos efectos son independientes de los efectos de los iones. La presencia del grupo de cabeza no cargado fosfatidiletanolamina (PE) aumenta la fusión cuando se incorpora a una bicapa de fosfatidilcolina. Algunos han explicado este fenómeno como un efecto de deshidratación similar a la influencia del calcio. [8] El grupo de cabeza PE une el agua con menos fuerza que PC y, por lo tanto, puede permitir una aposición cercana más fácilmente. Una explicación alternativa es que la naturaleza física en lugar de la química del PE puede ayudar a inducir la fusión. Según la hipótesis del tallo de la fusión, se debe formar un puente muy curvado entre las dos bicapas para que se produzca la fusión. [9] Dado que el PE tiene un grupo de cabeza pequeño y forma fácilmente fases micelares invertidas , debería, según el modelo del tallo, promover la formación de estos tallos. [10] Otra evidencia citada a favor de esta teoría es el hecho de que se ha demostrado que ciertas mezclas de lípidos solo admiten la fusión cuando se elevan por encima de la temperatura de transición de estas fases invertidas. [11] [12] Este tema también sigue siendo controvertido, e incluso si hay una estructura curva presente en el proceso de fusión, existe un debate en la literatura sobre si se trata de una fase extendida cúbica, hexagonal o más exótica. [13]

Proteínas de fusión

Diagrama de la acción de las proteínas SNARE al acoplarse a una vesícula para la exocitosis. Las versiones complementarias de la proteína en la vesícula y la membrana diana se unen y se envuelven entre sí, acercándose las dos bicapas en el proceso. [14]

La situación se complica aún más cuando se considera la fusión in vivo, ya que la fusión biológica casi siempre está regulada por la acción de proteínas asociadas a la membrana . Las primeras de estas proteínas que se estudiaron fueron las proteínas de fusión viral, que permiten que un virus envuelto inserte su material genético en la célula huésped (los virus envueltos son aquellos rodeados por una bicapa lipídica; algunos otros solo tienen una cubierta de proteína). En términos generales, hay dos clases de proteínas de fusión virales: ácidas e independientes del pH. [1] Las proteínas de fusión independientes del pH pueden funcionar en condiciones neutras y fusionarse con la membrana plasmática , lo que permite la entrada viral en la célula. Los virus que utilizan este esquema incluyen VIH , sarampión y herpes . Las proteínas de fusión ácidas, como las que se encuentran en la influenza, solo se activan cuando están en el pH bajo de los endosomas ácidos y primero deben ser endocitadas para ingresar a la célula.

Las células eucariotas utilizan clases completamente diferentes de proteínas de fusión, de las cuales las más estudiadas son las SNARE . Las proteínas SNARE se utilizan para dirigir todo el tráfico intracelular vesicular . A pesar de años de estudio, todavía se desconoce mucho sobre la función de esta clase de proteínas. De hecho, todavía existe un debate activo sobre si las SNARE están vinculadas al acoplamiento temprano o participan más tarde en el proceso de fusión al facilitar la hemifusión. [15] Incluso una vez que se esclarezca el papel de las SNARE u otras proteínas específicas, es poco probable que se llegue a una comprensión unificada de las proteínas de fusión, ya que existe una enorme diversidad de estructura y función dentro de estas clases, y se conservan muy pocos temas. [16]

La fusión en la práctica de laboratorio

En los estudios de biología molecular y celular, a menudo es deseable inducir artificialmente la fusión. Aunque esto se puede lograr con la adición de calcio como se discutió anteriormente, este procedimiento a menudo no es factible porque el calcio regula muchos otros procesos bioquímicos y su adición sería un fuerte factor de confusión. Además, como se mencionó, el calcio induce agregación masiva así como fusión. La adición de polietilenglicol (PEG) causa fusión sin agregación significativa o alteración bioquímica. Este procedimiento ahora se usa ampliamente, por ejemplo, fusionando células B con células de mieloma . [17] El " hibridoma " resultante de esta combinación expresa un anticuerpo deseado según lo determinado por la célula B involucrada, pero se inmortaliza debido al componente de mieloma. El mecanismo de fusión de PEG no se ha identificado definitivamente, pero algunos investigadores creen que el PEG, al unirse a una gran cantidad de moléculas de agua, disminuye efectivamente la actividad química del agua y, por lo tanto, deshidrata los grupos de cabeza de lípidos. [18] La fusión también se puede inducir artificialmente a través de electroporación en un proceso conocido como electrofusión. Se cree que este fenómeno es resultado de los bordes energéticamente activos formados durante la electroporación, que pueden actuar como punto de defecto local para nuclear el crecimiento del tallo entre dos bicapas. [19]

Como alternativa, se pueden utilizar sistemas modelo inspirados en SNARE para inducir la fusión de vesículas lipídicas en la membrana. En esos sistemas, el ADN complementario anclado a la membrana, [20] [21] [22] el PNA, [23] los péptidos, [24] u otras moléculas [25] se "unen" y acercan las membranas. Estos sistemas podrían tener aplicaciones prácticas en el futuro, por ejemplo, en la administración de fármacos. [26] El sistema probablemente mejor investigado [27] consiste en péptidos que forman espirales con carga complementaria (uno de ellos suele llevar un exceso de lisinas con carga positiva y, por lo tanto, se denomina péptido K, y otro, ácidos glutámicos con carga negativa, llamado péptido E). [28] Curiosamente, se descubrió que no solo es necesaria la formación de espirales entre los dos péptidos para que se produzca la fusión de la membrana, sino también que el péptido K interactúa con la superficie de la membrana y causa defectos locales. [29]

Ensayos para medir la fusión de membranas

Existen dos niveles de fusión: mezcla de lípidos de membrana y mezcla de contenidos. Los ensayos de fusión de membranas informan sobre la mezcla de lípidos de membrana o sobre la mezcla de los contenidos acuosos de las entidades fusionadas.

Ensayos para medir la mezcla de lípidos

Los ensayos que evalúan la mezcla de lípidos utilizan efectos dependientes de la concentración, como la transferencia de energía no radiactiva, la extinción de la fluorescencia y la formación de excímeros de pireno.

(1.) Ilustración del ensayo de mezcla de lípidos basado en la transferencia de energía de resonancia de Förster.
(3.) Ilustración del ensayo de mezcla de lípidos basado en la autoextinción de fluorescencia.
  1. Transferencia de energía de NBD-rodamina: [30] En este método, la membrana marcada con NBD (donante) y rodamina (aceptor) se combina con la membrana no marcada. Cuando NBD y rodamina se encuentran a cierta distancia, se produce la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET). Después de la fusión, la transferencia de energía por resonancia (FRET) disminuye cuando aumenta la distancia promedio entre las sondas, mientras que la fluorescencia de NBD aumenta.
  2. Formación del excímero de pireno: las longitudes de onda de emisión del monómero de pireno y del excímero son diferentes. La longitud de onda de emisión del monómero es de alrededor de 400 nm y la del excímero es de alrededor de 470 nm. En este método, la membrana marcada con pireno se combina con la membrana no marcada. El pireno se autoasocia en la membrana y luego el pireno excitado excita a otro pireno. Antes de la fusión, la mayoría de la emisión es de excímeros. Después de la fusión, la distancia entre las sondas aumenta y la proporción de emisión de excímeros disminuye. [ cita requerida ]
  3. Autoextinción de octadecil rodamina B: [31] Este ensayo se basa en la autoextinción de octadecil rodamina B. La autoextinción de octadecil rodamina B ocurre cuando la sonda se incorpora a lípidos de membrana en concentraciones de 1 a 10 por ciento en moles [32] porque los dímeros de rodamina extinguen la fluorescencia. En este método, la rodamina marcada en la membrana se combina con la membrana no marcada. La fusión con membranas no marcadas da como resultado la dilución de la sonda, que se acompaña de un aumento de la fluorescencia. [33] [34] El principal problema de este ensayo es la transferencia espontánea.

Ensayos para medir la mezcla de contenidos

La mezcla de contenidos acuosos de vesículas como resultado de lisis, fusión o permeabilidad fisiológica se puede detectar fluorométricamente utilizando trazadores solubles de bajo peso molecular.

(1.) Ilustración del ensayo de mezcla de contenido basado en el par de extinción de fluorescencia ANTS/DPX.
(2.)Ilustración del ensayo de mezcla de contenido basado en el par de mejora de fluorescencia Tb 3+ /DPA.
  1. Ensayos de extinción de fluorescencia con ANTS/DPX: [35] [36] ANTS es un fluoróforo polianiónico, mientras que DPX es un extintor catiónico. El ensayo se basa en la extinción por colisión de ellos. Se cargan poblaciones de vesículas separadas con ANTS o DPX, respectivamente. Cuando se produce la mezcla de contenidos, ANTS y ​​DPX colisionan y se extingue la fluorescencia de ANTS monitoreada a 530 nm, con excitación a 360 nm. Este método se realiza a pH ácido y alta concentración.
  2. Ensayos de mejora de la fluorescencia con Tb 3+ /DPA: [37] [38] Este método se basa en el hecho de que el quelato de Tb 3+ /DPA es 10.000 veces más fluorescente que el Tb 3+ solo. En el ensayo Tb 3+ /DPA, poblaciones de vesículas separadas se cargan con TbCl 3 o DPA. La formación del quelato de Tb 3+ /DPA se puede utilizar para indicar la fusión de vesículas. Este método es bueno para membranas libres de proteínas. [ cita requerida ]
  3. Ensayo de ADN de una sola molécula. [39] Una horquilla de ADN compuesta por un tallo de 5 pares de bases y un bucle de politimidina que está marcado con un donante (Cy3) y un aceptor (Cy5) en los extremos del tallo se encapsuló en la vesícula v-SNARE. Encapsulamos por separado múltiples cadenas de ADN de poliadenosina no marcadas en la vesícula t-SNARE. Si las dos vesículas, ambas de ~100 nm de diámetro, se acoplan y se forma un poro de fusión lo suficientemente grande entre ellas, las dos moléculas de ADN deberían hibridarse, abriendo la región del tallo de la horquilla y cambiando la eficiencia de transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) (E) entre Cy3 y Cy5 de un valor alto a uno bajo.

Véase también

Referencias

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