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ARN ribosómico 16S

Estructura molecular de la Subunidad 30S de Thermus thermophilus . Las proteínas se muestran en azul y la cadena única de ARN en naranja. [1]

El ARN ribosómico 16 S (o ARNr 16 S ) es el componente de ARN de la subunidad 30S de un ribosoma procariótico ( ARNr SSU ). Se une a la secuencia Shine-Dalgarno y proporciona la mayor parte de la estructura SSU.

Los genes que lo codifican se denominan genes 16S rRNA y se utilizan en la reconstrucción de filogenias , debido a las lentas tasas de evolución de esta región del gen. [2] Carl Woese y George E. Fox fueron dos de las personas que fueron pioneras en el uso del ARNr 16S en filogenética en 1977. [3] Pueden existir múltiples secuencias del gen ARNr 16S dentro de una sola bacteria . [4]

Funciones

Estructura

SSU ARN ribosómico, bacterias y arqueas. De Woese 1987. [6]

Imprimaciones universales

El gen 16S rRNA se utiliza para estudios filogenéticos [7] ya que está altamente conservado entre diferentes especies de bacterias y arqueas. [8] Carl Woese fue pionero en este uso del ARNr 16S en 1977. [2] Se sugiere que el gen ARNr 16S puede usarse como un reloj molecular confiable porque se ha demostrado que las secuencias de ARNr 16S de linajes bacterianos relacionados lejanamente tienen funcionalidades similares. [9] Algunas arqueas termófilas (por ejemplo, el orden Thermoproteales ) contienen intrones del gen 16S rRNA que se encuentran en regiones altamente conservadas y pueden afectar el recocido de cebadores "universales" . [10] También se amplifican los ARNr mitocondriales y cloroplásticos . [11]

El par de cebadores más común fue ideado por Weisburg et al. (1991) [7] y actualmente se conoce como 27F y 1492R; sin embargo, para algunas aplicaciones pueden ser necesarios amplicones más cortos , por ejemplo, para la secuenciación 454 con química de titanio, el par de cebadores 27F-534R que cubre V1 a V3. [12] A menudo se utiliza 8F en lugar de 27F. Los dos cebadores son casi idénticos, pero el 27F tiene una M en lugar de una C. AGAGTTTGATC M TGGCTCAG en comparación con el 8F. [13]

Aplicaciones PCR y NGS

Además de los sitios de unión de cebadores altamente conservados, las secuencias del gen 16S rRNA contienen regiones hipervariables que pueden proporcionar secuencias distintivas específicas de especies útiles para la identificación de bacterias. [21] [22] Como resultado, la secuenciación del gen 16S rRNA se ha vuelto frecuente en la microbiología médica como una alternativa rápida y económica a los métodos fenotípicos de identificación bacteriana. [23] Aunque originalmente se usó para identificar bacterias, posteriormente se descubrió que la secuenciación 16S era capaz de reclasificar bacterias en especies completamente nuevas , [24] o incluso géneros . [7] [25] También se ha utilizado para describir nuevas especies que nunca se han cultivado con éxito. [26] [27] Con la llegada de la secuenciación de tercera generación a muchos laboratorios, es posible la identificación simultánea de miles de secuencias de ARNr 16S en cuestión de horas, lo que permite estudios metagenómicos , por ejemplo, de la flora intestinal . [28]

Regiones hipervariables

El gen bacteriano 16S contiene nueve regiones hipervariables (V1-V9), con una longitud de aproximadamente 30 a 100 pares de bases , que están involucradas en la estructura secundaria de la subunidad ribosomal pequeña . [29] El grado de conservación varía ampliamente entre regiones hipervariables, con regiones más conservadas correlacionadas con una taxonomía de nivel superior y regiones menos conservadas con niveles más bajos, como género y especie. [30] Si bien la secuencia 16S completa permite la comparación de todas las regiones hipervariables, con aproximadamente 1500 pares de bases de largo puede resultar prohibitivamente costosa para los estudios que buscan identificar o caracterizar diversas comunidades bacterianas. [30] Estos estudios utilizan comúnmente la plataforma Illumina , que produce lecturas a velocidades 50 y 12 000 veces menos costosas que la pirosecuenciación 454 y la secuenciación Sanger , respectivamente. [31] Si bien es más económica y permite una cobertura comunitaria más profunda, la secuenciación de Illumina solo produce lecturas de 75 a 250 pares de bases de largo (hasta 300 pares de bases con Illumina MiSeq) y no tiene un protocolo establecido para ensamblar de manera confiable el gen completo en muestras comunitarias. [32] Sin embargo, se pueden ensamblar regiones hipervariables completas a partir de una sola ejecución de Illumina, lo que las convierte en objetivos ideales para la plataforma. [32]

Si bien las regiones hipervariables 16S pueden variar dramáticamente entre bacterias, el gen 16S en su conjunto mantiene una mayor homogeneidad de longitud que su contraparte eucariótica ( ARN ribosómico 18S ), lo que puede facilitar los alineamientos . [33] Además, el gen 16S contiene secuencias altamente conservadas entre regiones hipervariables, lo que permite el diseño de cebadores universales que pueden producir de manera confiable las mismas secciones de la secuencia 16S en diferentes taxones . [34] Aunque ninguna región hipervariable puede clasificar con precisión todas las bacterias desde el dominio hasta la especie, algunas pueden predecir de manera confiable niveles taxonómicos específicos. [30] Muchos estudios comunitarios seleccionan regiones hipervariables semiconservadas como la V4 por este motivo, ya que puede proporcionar resolución a nivel de filo con tanta precisión como el gen 16S completo. [30] Si bien las regiones menos conservadas luchan por clasificar nuevas especies cuando se desconoce la taxonomía de orden superior, a menudo se utilizan para detectar la presencia de patógenos específicos. En un estudio de Chakravorty et al. En 2007, los autores caracterizaron las regiones V1-V8 de una variedad de patógenos para determinar qué regiones hipervariables serían más útiles para incluir en ensayos amplios y específicos de la enfermedad . [35] Entre otros hallazgos, observaron que la región V3 era mejor para identificar el género de todos los patógenos analizados, y que la V6 era la más precisa para diferenciar especies entre todos los patógenos analizados por los CDC , incluido el ántrax . [35]

Si bien el análisis de la región hipervariable 16S es una herramienta poderosa para los estudios taxonómicos bacterianos, tiene dificultades para diferenciar entre especies estrechamente relacionadas. [34] En las familias Enterobacteriaceae , Clostridiaceae y Peptostreptococcaceae , las especies pueden compartir hasta un 99% de similitud de secuencia en todo el gen 16S. [36] Como resultado, las secuencias V4 pueden diferir solo en unos pocos nucleótidos , lo que deja a las bases de datos de referencia incapaces de clasificar de manera confiable estas bacterias en niveles taxonómicos más bajos. [36] Al limitar el análisis 16S a seleccionar regiones hipervariables, estos estudios pueden no observar diferencias en taxones estrechamente relacionados y agruparlos en unidades taxonómicas únicas, subestimando así la diversidad total de la muestra. [34] Además, los genomas bacterianos pueden albergar múltiples genes 16S, y las regiones V1, V2 y V6 contienen la mayor diversidad intraespecies. [8] Si bien no es el método más preciso para clasificar especies bacterianas, el análisis de las regiones hipervariables sigue siendo una de las herramientas más útiles disponibles para los estudios de comunidades bacterianas. [36]

Promiscuidad de los genes 16S rRNA

Bajo el supuesto de que la evolución está impulsada por la transmisión vertical , durante mucho tiempo se ha creído que los genes 16S rRNA son específicos de cada especie e infalibles como marcadores genéticos que infieren relaciones filogenéticas entre procariotas . Sin embargo, un número creciente de observaciones sugiere la existencia de una transferencia horizontal de estos genes. Además de las observaciones de ocurrencia natural, la transferibilidad de estos genes se respalda experimentalmente utilizando un sistema genético especializado de Escherichia coli . Utilizando un mutante nulo de E. coli como huésped, se demostró que el crecimiento de la cepa mutante se complementaba con genes extraños de ARNr 16S que eran filogenéticamente distintos de E. coli a nivel de filo. [37] [38] Esta compatibilidad funcional también se observó en Thermus thermophilus . [39] Además, en T. thermophilus , se observó transferencia genética tanto completa como parcial. La transferencia parcial dio como resultado la generación espontánea de quimeras aparentemente aleatorias entre el huésped y los genes bacterianos extraños. Por tanto, los genes 16S rRNA pueden haber evolucionado a través de múltiples mecanismos, incluida la herencia vertical y la transferencia horizontal de genes ; la frecuencia de este último puede ser mucho mayor de lo que se pensaba anteriormente. [40]

Bases de datos ribosomales 16S

El gen 16S rRNA se utiliza como estándar para la clasificación e identificación de microbios, porque está presente en la mayoría de los microbios y muestra los cambios adecuados. [41] Las cepas tipo de secuencias del gen 16S rRNA para la mayoría de las bacterias y arqueas están disponibles en bases de datos públicas, como NCBI . Sin embargo, la calidad de las secuencias encontradas en estas bases de datos a menudo no está validada. Por lo tanto, se utilizan ampliamente bases de datos secundarias que recopilan solo secuencias de ARNr 16S. Las bases de datos más utilizadas se enumeran a continuación:

MIMT

MIMt es una base de datos 16S compacta y no redundante para una rápida identificación de muestras metagenómicas. Está compuesto por 39.940 secuencias completas de 16S pertenecientes a 17.625 especies de bacterias y arqueas bien clasificadas. Todas las secuencias se obtuvieron de genomas completos depositados en NCBI y para cada una de las secuencias se proporciona la jerarquía taxonómica completa. No contiene redundancia, por lo que se consideró solo un representante para cada especie evitando las mismas secuencias de diferentes cepas, aislados o patovares, resultando en una herramienta muy rápida para la identificación de microorganismos, compatible con cualquier software de clasificación (QIIME, Mothur, DADA, etc).[42]

EzBioCloud

La base de datos EzBioCloud, anteriormente conocida como EzTaxon , consta de un sistema taxonómico jerárquico completo que contiene 62,988 especies/filotipos de bacterias y arqueas que incluye 15,290 nombres publicados válidos a septiembre de 2018. Según la relación filogenética, como máxima probabilidad y OrthoANI, todas las especies/ Las subespecies están representadas por al menos una secuencia del gen 16S rRNA. La base de datos EzBioCloud se actualiza sistemáticamente y se actualiza periódicamente, lo que también incluye nuevas especies candidatas. Además, el sitio web proporciona herramientas bioinformáticas como la calculadora ANI, ContEst16S y 16S rRNA DB para QIIME y Mothur Pipeline. [43]

Proyecto de base de datos ribosómica

El Proyecto de base de datos ribosomal (RDP) es una base de datos seleccionada que ofrece datos de ribosomas junto con programas y servicios relacionados. Las ofertas incluyen alineamientos ordenados filogenéticamente de secuencias de ARN ribosómico (ARNr), árboles filogenéticos derivados, diagramas de estructura secundaria de ARNr y varios paquetes de software para manejar, analizar y mostrar alineamientos y árboles. Los datos están disponibles vía ftp y correo electrónico. Ciertos servicios analíticos también son proporcionados por el servidor de correo electrónico. [44] Debido a su gran tamaño, la base de datos RDP se utiliza a menudo como base para el desarrollo de herramientas bioinformáticas y la creación de bases de datos seleccionadas manualmente. [45]

SILVA

SILVA proporciona conjuntos de datos completos, de calidad comprobada y actualizados periódicamente de secuencias alineadas de ARN ribosomal (ARNr) de subunidades pequeñas (16S/ 18S , SSU ) y grandes ( 23S / 28S , LSU ) para los tres dominios de la vida, así como un conjunto de herramientas de búsqueda, Herramientas de diseño y alineación de cebadores (Bacteria, Archaea y Eukarya). [46]

genes verdes

GreenGenes es una taxonomía y una base de datos de referencia del gen 16S rRNA integral y con control de calidad basada en una filogenia de novo que proporciona conjuntos de unidades taxonómicas operativas estándar. Tenga en cuenta que utiliza términos taxonómicos propuestos a partir de métodos filogenéticos aplicados hace años, entre 2012 y 2013. Desde entonces, se han propuesto una variedad de métodos filogenéticos novedosos para Archaea y Bacteria. [47] [48]

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