Una suspensión celular o cultivo en suspensión es un tipo de cultivo celular en el que se permite que células individuales o pequeños agregados de células funcionen y se multipliquen en un medio de crecimiento agitado , formando así una suspensión . El cultivo en suspensión es uno de los dos tipos clásicos de cultivo celular, siendo el otro el cultivo adherente . La historia del cultivo celular en suspensión se alinea estrechamente con la historia del cultivo celular en general, pero difiere en los métodos de mantenimiento y las aplicaciones comerciales. Las propias células pueden derivarse de tejido homogeneizado o de soluciones celulares heterogéneas. El cultivo de células en suspensión se usa comúnmente para cultivar líneas celulares no adhesivas como células hematopoyéticas , células vegetales y células de insectos . [1] Si bien algunas líneas celulares se cultivan en suspensión, la mayoría de las líneas celulares de mamíferos disponibles comercialmente son adherentes. [2] [3] Los cultivos celulares en suspensión deben agitarse para mantener las células en suspensión y pueden requerir equipo especializado (p. ej., placa de agitación magnética, agitadores orbitales, incubadoras) y matraces (p. ej., matraces de cultivo, matraces giratorios, matraces agitadores). [4] Estos cultivos deben mantenerse con medios que contengan nutrientes y cultivarse en un rango de densidad celular específico para evitar la muerte celular. [5]
La historia del cultivo de células en suspensión está estrechamente ligada a la historia general del cultivo de células y tejidos. En 1885, Wilhelm Roux sentó las bases para el futuro cultivo de tejidos al desarrollar un tampón salino que se utilizó para mantener las células vivas (embriones de pollo) durante unos días. [6] Ross Granville Harrison en 1907 desarrolló técnicas de cultivo celular in vitro , incluida la modificación de la técnica de la gota colgante para células nerviosas y la introducción de una técnica aséptica en el proceso de cultivo. [7] Más tarde, en 1910, Montrose Thomas Burrows adaptó la técnica de Harrison y colaboró con Alexis Carrel para establecer múltiples cultivos de tejidos que pudieran mantenerse in vitro utilizando plasma fresco combinado con soluciones salinas. [8] Carrel pasó a desarrollar la primera línea celular conocida, una línea derivada del corazón de embrión de pollo que se mantuvo de forma continua durante 34 años. [9] Aunque Leonard Hayflick cuestionó más tarde la "inmortalidad" de la línea celular , este fue un gran avance e inspiró a otros a seguir creando otras líneas celulares. [10] En particular, en 1952, George Otto Gay y su asistente Mary Kubicek cultivaron la primera línea celular inmortalizada derivada de humanos: HeLa . Mientras que las otras líneas celulares eran adherentes, las células HeLa pudieron mantenerse en suspensión. [11]
Todas las células primarias (células derivadas directamente de un sujeto) primero deben extraerse de un sujeto, aislarse (usando enzimas de digestión) y suspenderse en un medio antes de cultivarse. [1] Sin embargo, esto no significa que estas células sean compatibles con el cultivo en suspensión, ya que la mayoría de las células de mamíferos son adherentes y necesitan adherirse a una superficie para dividirse. Se pueden tomar glóbulos blancos de un sujeto y cultivarlos en suspensión, ya que existen naturalmente en suspensión en la sangre. [12] La adhesión de glóbulos blancos in vivo suele ser el resultado de una respuesta inmunitaria inflamatoria y requiere interacciones célula-célula específicas que no deberían ocurrir en una suspensión de un solo tipo de glóbulo blanco. [13]
Las líneas celulares de mamíferos inmortalizadas (células que pueden replicarse indefinidamente), células vegetales y células de insectos se pueden obtener criopreservadas de los fabricantes y usarse para iniciar un cultivo en suspensión. [14] Para iniciar un cultivo a partir de células criopreservadas, las células primero deben descongelarse y agregarse a un matraz o biorreactor que contenga medio. Dependiendo del agente crioprotector, es posible que sea necesario lavar las células para evitar efectos nocivos del agente. [3]
Los cultivos celulares en suspensión son similares a los cultivos adherentes en varios aspectos. Ambos requieren medios especializados que contengan nutrientes, recipientes que permitan la transferencia de gas, condiciones asépticas para evitar la contaminación y pases frecuentes para evitar el hacinamiento de las células. Sin embargo, incluso dentro de estas similitudes existen algunas diferencias clave entre estos métodos de cultivo. Por ejemplo, aunque los cultivos celulares tanto adherentes como en suspensión se pueden mantener en matraces estándar como el matraz de cultivo de tejidos T-75, los cultivos en suspensión deben agitarse para evitar que se sedimenten en el fondo del matraz. Si bien los cultivos celulares adherentes se pueden mantener en matraces planos con mucha superficie (para promover la adhesión celular), los cultivos en suspensión requieren agitación, de lo contrario las células caerán al fondo del matraz, lo que afectará en gran medida su acceso a nutrientes y oxígeno, lo que eventualmente resultará en en la muerte celular. [4] Por esta razón, se han desarrollado matraces especializados (incluidos el matraz giratorio y el matraz agitador, que se analizan a continuación) para agitar los medios y mantener las células en suspensión. Sin embargo, la agitación de los medios somete a las células a fuerzas de corte que pueden estresarlas y afectar negativamente el crecimiento. Aunque tanto los cultivos celulares adherentes como los en suspensión requieren medios, los medios utilizados en el cultivo en suspensión pueden contener un tensioactivo para proteger las células de las fuerzas de corte además de los aminoácidos, las vitaminas y la solución salina contenida en los medios de cultivo como DMEM . [5]
Los matraces giratorios, que se utilizan para cultivos en suspensión, contienen una barra giratoria magnética que hace circular el medio por todo el matraz y mantiene las células en suspensión. [15] Los matraces giratorios contienen una abertura central tapada flanqueada por dos brazos salientes que también están tapados y permiten un intercambio de gas adicional. La propia barra giratoria magnética normalmente está suspendida de una varilla unida a la tapa central para maximizar la circulación del medio en la suspensión celular. Al cultivar células, el matraz giratorio que contiene las células se coloca en una placa de agitación magnética, dentro de una incubadora y los parámetros del centrifugador deben ajustarse cuidadosamente para evitar matar las células con fuerzas de corte. [dieciséis]
Los matraces agitadores también se utilizan para cultivos en suspensión y parecen similares a los matraces Erlenmeyer típicos, pero tienen una tapa semipermeable para permitir el intercambio de gases. [17] Durante el cultivo de células en suspensión, los matraces agitadores se cargan con células y el medio apropiado antes de colocarlos en un agitador orbital. Para optimizar la proliferación del cultivo celular, las revoluciones por minuto del agitador orbital deben ajustarse dentro de un rango aceptable dependiendo de las células y los medios utilizados. Se debe permitir que los medios se agiten, pero no pueden alterar demasiado las células causándoles un estrés excesivo. Los matraces agitadores se utilizan a menudo para cultivos de fermentación con microorganismos como la levadura. [18]
Pasar o subcultivar cultivos celulares en suspensión es más sencillo que pasar células adherentes. Si bien las células adherentes requieren un procesamiento inicial con una enzima de digestión, para eliminarlas de la superficie del matraz de cultivo, las células en suspensión flotan libremente en el medio. [19] Luego se puede tomar y analizar una muestra del cultivo para determinar la proporción de células vivas y muertas (usando un tinte como azul tripán ) y la concentración total de células en el matraz (usando un hemocitómetro ). Con esta información, una parte del cultivo en suspensión actual se transferirá a un matraz nuevo y se complementará con medio. Se debe registrar el número de pases, especialmente si las células son primarias y no están inmortalizadas, ya que las líneas celulares primarias eventualmente sufrirán senescencia . [20] Las células en suspensión a menudo se pasan directamente sin cambiar el medio. Para cambiar el medio para un cultivo en suspensión, todas las células del recipiente actual deben retirarse y centrifugarse hasta obtener un sedimento. Luego se retira el exceso de medio de la muestra centrifugada y el matraz se vuelve a llenar con medio nuevo antes de volver a agregar las células al matraz. Los cambios de medios y el subcultivo son importantes para mantener las líneas celulares, ya que las células consumirán nutrientes en los medios para expandirse. Las células también crecerán exponencialmente hasta que el ambiente se vuelva inhóspito debido a la falta de nutrientes, el pH extremo o la falta de espacio para crecer.
A diferencia de los cultivos adherentes , que están limitados por la superficie que se les proporciona para expandirse, los cultivos en suspensión están limitados por el volumen de su recipiente. Es decir, las células en suspensión pueden existir en cantidades mucho mayores en un matraz determinado y se prefieren cuando se usan células para fabricar productos que incluyen proteínas, anticuerpos, metabolitos o simplemente para producir un gran volumen de células. Sin embargo, hay muchas menos líneas celulares en suspensión de mamíferos que líneas celulares adhesivas de mamíferos. La mayoría de los cultivos en suspensión a gran escala involucran células de no mamíferos y se llevan a cabo en biorreactores.
Algunos ejemplos de cultivo de células en suspensión:
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: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace )