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Cromosoma artificial de levadura

Los cromosomas artificiales de levadura (YAC) son cromosomas modificados genéticamente derivados del ADN de la levadura, Saccharomyces cerevisiae [1], que luego se liga a un plásmido bacteriano. Al insertar grandes fragmentos de ADN, de 100 a 1000 kb, las secuencias insertadas se pueden clonar y mapear físicamente mediante un proceso llamado recorrido cromosómico . Este es el proceso que se utilizó inicialmente para el Proyecto Genoma Humano ; sin embargo, debido a problemas de estabilidad, los YAC se abandonaron para el uso de cromosomas artificiales bacterianos [2]

La levadura de panadería S. cerevisiae es uno de los organismos experimentales más importantes para el estudio de la genética molecular de eucariotas. [1]

A partir de la investigación inicial de Rankin et al., Strul et al. y Hsaio et al., el cromosoma inherentemente frágil se estabilizó al descubrir la secuencia de replicación autónoma (ARS) necesaria; [2] Un YAC refinado que utiliza estos datos fue descrito en 1983 por Murray et al. [3]

Los componentes principales de un YAC son el ARS, el centrómero [3] y los telómeros [4] de S. cerevisiae . Además, se utilizan genes marcadores seleccionables, tales como resistencia a antibióticos y un marcador visible, para seleccionar células de levadura transformadas. Sin estas secuencias, el cromosoma no será estable durante la replicación extracelular y no se distinguirá de las colonias sin el vector. [4]

Esta es una fotografía de dos copias de la Biblioteca YAC del Genoma Humano de la Universidad de Washington. Cada una de las pilas tiene aproximadamente 12 placas de microtitulación. Cada placa tiene 96 pocillos, cada uno con diferentes clones de levadura.

Construcción

Un YAC se construye utilizando un plásmido de ADN circular inicial , que normalmente se corta en una molécula de ADN lineal utilizando enzimas de restricción ; Luego, la ADN ligasa se utiliza para ligar una secuencia de ADN o un gen de interés en el ADN linealizado, formando una única pieza circular grande de ADN. [3] [5] La generación básica de cromosomas artificiales de levadura lineal se puede dividir en 6 pasos principales:

  1. Ligación del marcador seleccionable en un vector plasmídico: esto permite la selección diferencial de colonias con o sin el gen marcador. Un gen de resistencia a los antibióticos permite amplificar y seleccionar el vector YAC en E. coli rescatando la capacidad de la E. coli mutante para sintetizar leucina en presencia de los componentes necesarios dentro del medio de crecimiento. Los genes TRP1 y URA3 son otros marcadores seleccionables. El sitio de clonación del vector YAC para ADN extraño se encuentra dentro del gen SUP4 . Este gen compensa una mutación en la célula huésped de la levadura que provoca la acumulación de pigmento rojo. Las células huésped normalmente son rojas y las transformadas solo con YAC formarán colonias incoloras. La clonación de un fragmento de ADN extraño en el YAC provoca la inactivación por inserción del gen, restaurando el color rojo. Por tanto, las colonias que contienen el fragmento de ADN extraño son rojas. [5]
  2. Ligación de secuencias centroméricas necesarias para la estabilidad mitótica [6]
  3. Ligación de secuencias de replicación autónoma (ARS) que proporcionan un origen de replicación para sufrir una replicación mitótica. Esto permite que el plásmido se replique extracromosómicamente, pero lo vuelve altamente mitóticamente inestable y se pierde fácilmente sin las secuencias centroméricas. [4] [7]
  4. Ligación de secuencias teloméricas artificiales para convertir un plásmido circular en una pieza lineal de ADN [8]
  5. Inserción de secuencia de ADN a amplificar (hasta 1000kb)
  6. Colonia de levaduras de transformación [9]

Cromosoma III completo

El cromosoma III es el tercer cromosoma más pequeño de S. cerevisiae; su tamaño se estimó a partir de estudios de electroforesis en gel de campo pulsado en 300-360 kb [10]

Este cromosoma ha sido objeto de intensos estudios, sobre todo porque contiene los tres loci genéticos implicados en el control del tipo de apareamiento: MAT, HML y HMR. [11] En marzo de 2014, Jef Boeke del Centro Médico Langone de la Universidad de Nueva York, publicó que su equipo había sintetizado uno de los 16 cromosomas de la levadura S. cerevisiae , el cromosoma III, al que denominó synIII. [12] [13] El procedimiento implicó reemplazar los genes en el cromosoma original con versiones sintéticas y el cromosoma sintetizado terminado luego se integró en una célula de levadura. Fue necesario diseñar y crear 273.871 pares de bases de ADN, menos que los 316.667 pares del cromosoma original.

Usos en biotecnología

Los vectores de expresión de levadura, como YAC, YIps (plásmidos integradores de levadura) y YEps (plásmidos episomales de levadura), tienen una ventaja sobre los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) porque pueden usarse para expresar proteínas eucariotas que requieren modificación postraduccional . Al poder insertar grandes fragmentos de ADN, los YAC se pueden utilizar para clonar y ensamblar genomas completos de un organismo. [14] Con la inserción de un YAC en células de levadura, se pueden propagar como cromosomas artificiales lineales, clonando las regiones insertadas de ADN en el proceso. Una vez completado esto, se pueden utilizar dos procesos para obtener un genoma secuenciado o región de interés:

  1. Mapeo físico [6]
  2. Caminata cromosómica [15]

Esto es importante porque permite el mapeo detallado de regiones específicas del genoma. Se han examinado cromosomas humanos completos, como el cromosoma X, [16] generando la ubicación de marcadores genéticos para numerosos trastornos y rasgos genéticos. [17]

Esquema del plásmido pBR322 generado en el Laboratorio Boyer de la UC San Francisco por Bolívar y Rodríguez en 1972. Es uno de los primeros y más utilizados vectores, y la base de los YAC creados por Murray y Szostak en 1983. El plásmido contiene ampicilina. y genes de resistencia a tetraciclina, y un conjunto de sitios diana de enzimas de restricción para insertar fragmentos de ADN.

El Proyecto Genoma Humano

En los Estados Unidos, el Proyecto Genoma Humano tomó forma clara por primera vez en febrero de 1988, con la publicación del informe Mapping and Sequencing the Human Genome del Consejo Nacional de Investigación (NRC). [18] Los YAC son significativamente menos estables que los BAC y producen "efectos quiméricos": artefactos en los que la secuencia del ADN clonado en realidad no corresponde a una única región genómica sino a múltiples regiones. El quimerismo puede deberse a la coligación de múltiples segmentos genómicos en un solo YAC o a la recombinación de dos o más YAC transformados en la misma célula de levadura huésped. [19] La incidencia del quimerismo puede llegar al 50%. [20] Otros artefactos son la eliminación de segmentos de una región clonada y la reordenación de segmentos genómicos (como la inversión). En todos estos casos, la secuencia determinada a partir del clon YAC es diferente de la secuencia natural original, lo que conduce a resultados inconsistentes y errores de interpretación si se confía en la información del clon. Debido a estos problemas, el Proyecto Genoma Humano finalmente abandonó el uso de YAC y cambió a cromosomas artificiales bacterianos , donde la incidencia de estos artefactos es muy baja. Además de los problemas de estabilidad, específicamente la aparición relativamente frecuente de eventos quiméricos, los YAC demostraron ser ineficientes al generar la ruta mínima de mosaico que cubre todo el genoma humano. Generar las bibliotecas de clones lleva mucho tiempo. Además, debido a la naturaleza de la dependencia de los sitios etiquetados con secuencia (STS) como punto de referencia al seleccionar clones apropiados, existen grandes lagunas que necesitan una mayor generación de bibliotecas para cubrir. Es este obstáculo adicional el que impulsó al proyecto a utilizar BAC. [21] Esto se debe a dos factores: [22]

  1. Los BAC son mucho más rápidos de generar y, al generar bibliotecas redundantes de clones, esto es esencial.
  2. Los BAC permiten una cobertura más densa con STS, lo que da como resultado rutas de mosaico mínimas más completas y eficientes generadas in silico.

Sin embargo, es posible utilizar ambos enfoques, como se demostró cuando se analizó el genoma del nematodo C. elegans . La mayor parte del genoma estaba repleto de BAC y los huecos se rellenaron con YAC. [21]

Ver también

Referencias

  1. ^ La biología molecular de la levadura Saccharomyces: metabolismo y expresión genética. Cold Spring Harbor, Nueva York: Laboratorio Cold Spring Harbor. 1982.ISBN​ 0-87969-149-2.
  2. ^ Hsiao CL, Carbon J (agosto de 1979). "Transformación de alta frecuencia de levadura mediante plásmidos que contienen el gen ARG4 de levadura clonado". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 76 (8): 3829–33. Código bibliográfico : 1979PNAS...76.3829H. doi : 10.1073/pnas.76.8.3829 . PMC 383928 . PMID  386351. 
  3. ^ ab Murray AW, Szostak JW (1983). "Construcción de cromosomas artificiales en levadura". Naturaleza . 305 (5931): 189–93. Código Bib :1983Natur.305..189M. doi :10.1038/305189a0. PMID  6350893. S2CID  4337825.
  4. ^ ab Ratzkin B, Carbon J (febrero de 1977). "Expresión funcional del ADN de levadura clonado en Escherichia coli". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 74 (2): 487–91. Código bibliográfico : 1977PNAS...74..487R. doi : 10.1073/pnas.74.2.487 . PMC 392314 . PMID  322128. 
  5. ^ Strachan T. (2011). Genética molecular humana / Tom Strachan y Andrew Read, 4ª ed.
  6. ^ Clarke L, Carbon J (octubre de 1980). "Aislamiento de un centrómero de levadura y construcción de pequeños cromosomas circulares funcionales". Naturaleza . 287 (5782): 504–9. Código Bib :1980Natur.287..504C. doi :10.1038/287504a0. PMID  6999364. S2CID  4348814.
  7. ^ Struhl K, Stinchcomb DT, Scherer S, Davis RW (marzo de 1979). "Transformación de alta frecuencia de levadura: replicación autónoma de moléculas de ADN híbridas". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 76 (3): 1035–9. Código bibliográfico : 1979PNAS...76.1035S. doi : 10.1073/pnas.76.3.1035 . PMC 383183 . PMID  375221. 
  8. ^ Kiss GB, Amin AA, Pearlman RE (junio de 1981). "Dos regiones separadas del ácido desoxirribonucleico ribosómico extracromosómico de Tetrahymena thermophila permiten la replicación autónoma de plásmidos en Saccharomyces cerevisiae". Biología Molecular y Celular . 1 (6): 535–43. doi :10.1128/mcb.1.6.535. PMC 369696 . PMID  6765606. 
  9. ^ Burke DT, Carle GF, Olson MV (mayo de 1987). "Clonación de grandes segmentos de ADN exógeno en levadura mediante vectores cromosómicos artificiales". Ciencia . 236 (4803): 806–12. Código bibliográfico : 1987 Ciencia... 236..806B. doi : 10.1126/ciencia.3033825. PMID  3033825.
  10. ^ Oliver, SG; et al. (mayo de 1992). "La secuencia completa de ADN del cromosoma III de la levadura". Naturaleza . 357 (6373): 38–46. Código Bib :1992Natur.357...38O. doi :10.1038/357038a0. PMID  1574125. S2CID  4271784.
  11. ^ Strathern, JN, Newlon, CS, Herskowitz, I. y Hicks, JB (mayo de 1992). "La secuencia completa de ADN del cromosoma III de la levadura". Naturaleza . Celúla. 18 (6373) (publicado en 1979): 309–319. Código Bib :1992Natur.357...38O. doi :10.1038/357038a0. PMID  1574125. S2CID  4271784.{{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace )
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  14. ^ Burke, D., Carle, G. & Olson, M. Clonación de grandes segmentos de ADN exógeno en levadura mediante vectores cromosómicos artificiales. Ciencia 236, 806–812 (1987).
  15. ^ Kere, J.; Nagaraja, R.; Mamá, S.; Ciccodicola, A.; D'Urso, M. (1992). "Mapeo de cromosomas humanos caminando con sitios etiquetados con secuencias de fragmentos finales de inserciones de cromosomas artificiales de levadura". Genómica . 14 (2): 241–248. doi :10.1016/s0888-7543(05)80212-5. PMID  1427839.
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enlaces externos