Un cribado genético o cribado de mutagénesis es una técnica experimental que se utiliza para identificar y seleccionar individuos que poseen un fenotipo de interés en una población mutagenizada. [1] Por lo tanto, un cribado genético es un tipo de cribado fenotípico . Los cribados genéticos pueden proporcionar información importante sobre la función de los genes , así como sobre los eventos moleculares que subyacen a un proceso o vía biológica. Si bien los proyectos genómicos han identificado un amplio inventario de genes en muchos organismos diferentes, los cribados genéticos pueden proporcionar información valiosa sobre cómo funcionan esos genes. [2] [3] [4] [5] [6]
La genética directa (o cribado genético directo) comienza con un fenotipo y luego intenta identificar la mutación causante y, por lo tanto, el gen o los genes responsables del fenotipo. Por ejemplo, el famoso cribado de Christiane Nüsslein-Volhard y Eric Wieschaus mutagenizó moscas de la fruta y luego se propuso encontrar los genes que causaban los fenotipos mutantes observados. [7]
Para que los análisis genéticos directos tengan éxito, es necesario contar con un trasfondo genético definido y un procedimiento experimental simple. Es decir, cuando se mutagenizan varios individuos, estos deben ser genéticamente idénticos para que su fenotipo de tipo salvaje también sea idéntico y los fenotipos mutantes sean más fáciles de identificar. Un método de análisis simple permite analizar un mayor número de individuos, lo que aumenta la probabilidad de generar e identificar mutantes de interés. [3]
Dado que las mutaciones alélicas naturales son raras antes del cribado, los genetistas a menudo mutagenizan una población de individuos exponiéndolos a un mutágeno conocido , como una sustancia química o una radiación, generando así una frecuencia mucho mayor de mutaciones cromosómicas . [1] En algunos organismos, los mutágenos se utilizan para realizar cribado de saturación , es decir, un cribado utilizado para descubrir todos los genes implicados en un fenotipo particular. Christiane Nüsslein-Volhard y Eric Wieschaus fueron las primeras personas en realizar este tipo de procedimiento de cribado en animales. [8]
La genética inversa (o un cribado genético inverso) comienza con un gen conocido y analiza el efecto de su alteración mediante el análisis de los fenotipos resultantes. Por ejemplo, en un cribado de eliminación, se eliminan por completo uno o más genes y se analizan los mutantes eliminados para determinar sus fenotipos. Se han realizado cribados de este tipo para todos los genes de muchas bacterias e incluso organismos complejos, como C. elegans . [1] Un cribado genético inverso suele comenzar con una secuencia de genes seguida de una inactivación dirigida. [9] Además, induce mutaciones en organismos modelo para conocer su papel en la enfermedad. [10] La genética inversa también se utiliza para proporcionar estadísticas extremadamente precisas sobre las mutaciones que se producen en genes específicos. A partir de estos cribado, se puede determinar qué tan fortuitas son las mutaciones y con qué frecuencia se producen. [11]
Se han ideado muchas variaciones de detección para dilucidar un gen que conduce a un fenotipo mutante de interés.
Un análisis de potenciadores comienza con un individuo mutante que tiene un proceso de interés afectado con una mutación genética conocida. El análisis puede utilizarse entonces para identificar genes adicionales o mutaciones genéticas que desempeñan un papel en ese proceso biológico o fisiológico. Un análisis de potenciadores genéticos identifica mutaciones que potencian un fenotipo de interés en un individuo ya mutante. El fenotipo del doble mutante (individuo con la mutación potenciadora y la mutación de fondo original) es más prominente que cualquiera de los fenotipos del mutante simple. La potenciación debe superar los fenotipos esperados de las dos mutaciones por sí solas y, por lo tanto, cada mutación puede considerarse potenciadora de la otra. El aislamiento de mutantes potenciadores puede conducir a la identificación de genes que interactúan o genes que actúan de forma redundante entre sí. [12]
Una prueba de supresión se utiliza para identificar mutaciones supresoras que alivian o revierten el fenotipo de la mutación original, en un proceso definido como viabilidad sintética . [13] Las mutaciones supresoras se pueden describir como segundas mutaciones en un sitio del cromosoma distinto de la mutación en estudio, que suprimen el fenotipo de la mutación original. [14] Si la mutación está en el mismo gen que la mutación original, se conoce como supresión intragénica , mientras que una mutación ubicada en un gen diferente se conoce como supresión extragénica o supresión intergénica . [1] Las mutaciones supresoras son extremadamente útiles para definir las funciones de las vías bioquímicas dentro de una célula y las relaciones entre diferentes vías bioquímicas.
Un cribado sensible a la temperatura implica realizar cambios de temperatura para mejorar un fenotipo mutante. Una población cultivada a bajas temperaturas tendría un fenotipo normal; sin embargo, la mutación en el gen particular lo haría inestable a una temperatura más alta. Un cribado de sensibilidad a la temperatura en moscas de la fruta, por ejemplo, podría implicar aumentar la temperatura en la jaula hasta que algunas moscas se desmayen, y luego abrir un portal para dejar escapar a las demás. Los individuos seleccionados en un cribado son propensos a ser portadores de una versión inusual de un gen involucrado en el fenotipo de interés. Una ventaja de los alelos encontrados en este tipo de cribado es que el fenotipo mutante es condicional y puede activarse simplemente aumentando la temperatura. Una mutación nula en un gen de este tipo puede ser letal para el embrión y dichos mutantes no se detectarían en un cribado básico. Lee Hartwell y Paul Nurse llevaron a cabo de forma independiente un famoso cribado sensible a la temperatura para identificar mutantes defectuosos en el ciclo celular en S. cerevisiae y S. pombe , respectivamente.
El cribado de interferencia de ARN (RNAi) es esencialmente un cribado genético directo que utiliza una técnica de genética inversa. De manera similar a los cribados genéticos clásicos del pasado, el éxito de los estudios de RNAi a gran escala depende de un desarrollo cuidadoso de ensayos fenotípicos y su interpretación. [9] En Drosophila , el RNAi se ha aplicado en células cultivadas o in vivo para investigar las funciones de los genes y para afectar la función de genes individuales a escala de todo el genoma. El RNAi se utiliza para silenciar la expresión genética en Drosophila inyectando dsRNA en embriones tempranos e interfiriendo con los genes Frizzled y Frizzled2 creando defectos en el patrón embrionario que imitan la pérdida de la función de ausencia de alas. [15]
CRISPR/Cas se utiliza principalmente para análisis genéticos inversos. CRISPR tiene la capacidad de crear bibliotecas de miles de mutaciones genéticas precisas y puede identificar nuevos tumores, así como validar tumores más antiguos en la investigación del cáncer. La biblioteca de genes knockout CRISPR-Cas9 a escala genómica (GeCKO) dirigida a 18.080 genes con 64.751 secuencias guía únicas identifica genes esenciales para la viabilidad celular en el cáncer. El sistema CRISPR-Cas9 bacteriano para diseñar mutaciones de pérdida de función (LOF) y ganancia de función (GOF) en organoides intestinales humanos no transformados con el fin de demostrar un modelo de cáncer colorrectal (CCR) . También se puede utilizar para estudiar las consecuencias funcionales de las mutaciones in vivo al permitir la edición directa del genoma en células somáticas. [10]
Mediante el enfoque de la genética clásica , un investigador localizaría (mapearía) el gen en su cromosoma mediante el cruce con individuos que portan otros rasgos inusuales y recopilando estadísticas sobre la frecuencia con la que los dos rasgos se heredan juntos. Los genetistas clásicos habrían utilizado rasgos fenotípicos para mapear los nuevos alelos mutantes . Con el advenimiento de las secuencias genómicas para sistemas modelo como Drosophila melanogaster , Arabidopsis thaliana y C. elegans, se han identificado muchos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) que se pueden usar como rasgos para el mapeo. De hecho, la pantalla de Heidelberg , que permite la prueba masiva de mutantes y desarrollada en 1980 por Nüsslein-Volhard y Wieschaus , despejó el camino para futuros científicos en este campo. [4] Los SNP son los rasgos preferidos para el mapeo ya que son muy frecuentes, del orden de una diferencia por cada 1000 pares de bases, entre diferentes variedades de organismos. También se pueden utilizar mutágenos como inserciones aleatorias de ADN por transformación o transposones activos para generar nuevos mutantes. Estas técnicas tienen la ventaja de marcar los nuevos alelos con un marcador molecular (ADN) conocido que puede facilitar la rápida identificación del gen. [8]
La clonación posicional es un método de identificación de genes en el que un gen para un fenotipo específico se identifica solo por su ubicación cromosómica aproximada (pero no por su función); esto se conoce como región candidata . Inicialmente, la región candidata se puede definir utilizando técnicas como el análisis de ligamiento , y luego se utiliza la clonación posicional para limitar la región candidata hasta que se encuentran el gen y sus mutaciones. La clonación posicional generalmente implica el aislamiento de segmentos de ADN parcialmente superpuestos de bibliotecas genómicas para avanzar a lo largo del cromosoma hacia un gen específico. Durante el curso de la clonación posicional, es necesario determinar si el segmento de ADN que se está considerando actualmente es parte del gen.
Las pruebas utilizadas para este propósito incluyen la hibridación entre especies, la identificación de islas CpG no metiladas , el atrapamiento de exones , la selección directa de ADNc , el análisis informático de la secuencia de ADN, el cribado de mutaciones en individuos afectados y las pruebas de expresión génica. Para los genomas en los que se conocen las regiones de polimorfismos genéticos , la clonación posicional implica la identificación de polimorfismos que flanquean la mutación. Este proceso requiere que los fragmentos de ADN del marcador genético conocido más cercano se clonen y secuencien progresivamente, acercándose al alelo mutante con cada nuevo clon. Este proceso produce un mapa de contig del locus y se conoce como caminata cromosómica . Con la finalización de los proyectos de secuenciación del genoma como el Proyecto Genoma Humano , la clonación posicional moderna puede utilizar contigs ya preparados de las bases de datos de secuencias del genoma directamente.
Para cada nuevo clon de ADN se identifica un polimorfismo y se prueba en la población de mapeo para determinar su frecuencia de recombinación en comparación con el fenotipo mutante. Cuando el clon de ADN está en el alelo mutante o cerca de él, la frecuencia de recombinación debería ser cercana a cero. Si el recorrido cromosómico continúa a través del alelo mutante, los nuevos polimorfismos comenzarán a mostrar un aumento en la frecuencia de recombinación en comparación con el fenotipo mutante. Dependiendo del tamaño de la población de mapeo, el alelo mutante puede reducirse a una región pequeña (<30 Kb). Luego se requiere la comparación de secuencias entre el ADN de tipo salvaje y el mutante en esa región para localizar la mutación del ADN que causa la diferencia fenotípica.
La clonación posicional moderna permite extraer información de forma más directa de los proyectos de secuenciación genómica y de los datos existentes mediante el análisis de los genes de la región candidata. A continuación, se pueden priorizar los genes de la enfermedad de la región candidata, lo que podría reducir la cantidad de trabajo necesario. Los genes con patrones de expresión coherentes con el fenotipo de la enfermedad, que muestran una función (putativa) relacionada con el fenotipo o que son homólogos de otro gen vinculado al fenotipo son todos candidatos prioritarios. La generalización de las técnicas de clonación posicional de esta manera también se conoce como descubrimiento de genes posicionales.
La clonación posicional es un método eficaz para aislar genes de enfermedades de manera imparcial y se ha utilizado para identificar genes de enfermedades como la distrofia muscular de Duchenne , la enfermedad de Huntington y la fibrosis quística . Sin embargo, surgen complicaciones en el análisis si la enfermedad presenta heterogeneidad de locus.