En biología molecular , la proteinasa K ( EC 3.4.21.64, proteasa K , endopeptidasa K , proteinasa alcalina de Tritirachium , serina proteinasa de Tritirachium album , proteinasa K de Tritirachium album ) es una serina proteasa de amplio espectro . [2] [3] [4] La enzima fue descubierta en 1974 en extractos del hongo Parengyodontium album (anteriormente Engyodontium album o Tritirachium album ). [5] La proteinasa K es capaz de digerir el cabello ( queratina ), de ahí el nombre de "proteinasa K". El sitio predominante de escisión es el enlace peptídico adyacente al grupo carboxilo de aminoácidos alifáticos y aromáticos con grupos alfa amino bloqueados . Se utiliza comúnmente por su amplia especificidad. Esta enzima pertenece a la familia de las peptidasas S8 ( subtilisina ). El peso molecular de la proteinasa K es 28.900 daltons (28,9 kDa).
Activada por el calcio, la enzima digiere las proteínas preferentemente después de los aminoácidos hidrofóbicos (aminoácidos alifáticos, aromáticos y otros aminoácidos hidrofóbicos). Aunque los iones de calcio no afectan la actividad de la enzima, sí contribuyen a su estabilidad. Las proteínas se digieren completamente si el tiempo de incubación es largo y la concentración de proteasa lo suficientemente alta. Al eliminar los iones de calcio, la estabilidad de la enzima se reduce, pero la actividad proteolítica permanece. [6] La proteinasa K tiene dos sitios de unión para Ca 2+ , que se encuentran cerca del centro activo, pero no están directamente involucrados en el mecanismo catalítico. La actividad residual es suficiente para digerir las proteínas, que generalmente contaminan las preparaciones de ácidos nucleicos. Por lo tanto, la digestión con proteinasa K para la purificación de ácidos nucleicos generalmente se realiza en presencia de EDTA (inhibición de enzimas dependientes de iones metálicos como las nucleasas).
La proteinasa K también es estable en un amplio rango de pH (4-12), con un pH óptimo de pH 8,0. [5] Una elevación de la temperatura de reacción de 37 °C a 50-60 °C puede aumentar la actividad varias veces, como la adición de 0,5-1% de dodecil sulfato de sodio (SDS) o cloruro de guanidinio (3 M), tiocianato de guanidinio (1 M) y urea (4 M) [ disputado (para: no se cita ninguna fuente para la temperatura) – discutir ] . Las condiciones mencionadas anteriormente mejoran la actividad de la proteinasa K al hacer que sus sitios de escisión del sustrato sean más accesibles. Las temperaturas superiores a 65 °C, el ácido tricloroacético (TCA) o los inhibidores de la serina proteasa AEBSF , PMSF o DFP inhiben la actividad. La proteinasa K no será inhibida por cloruro de guanidinio , tiocianato de guanidinio , urea , Sarkosyl , Triton X-100 , Tween 20 , SDS , citrato , ácido yodoacético , EDTA o por otros inhibidores de la serina proteasa como Nα-Tosyl-Lys clorometilcetona (TLCK) y Nα-Tosyl-Phe clorometilcetona (TPCK) [ cita requerida ] .
Actividad de la proteasa K en tampones de uso común [7]
La proteinasa K se utiliza comúnmente en biología molecular para digerir proteínas y eliminar la contaminación de las preparaciones de ácido nucleico . La adición de proteinasa K a las preparaciones de ácido nucleico inactiva rápidamente las nucleasas que de otro modo podrían degradar el ADN o ARN durante la purificación. Es muy adecuada para esta aplicación, ya que la enzima es activa en presencia de sustancias químicas que desnaturalizan las proteínas, como SDS y urea , agentes quelantes como EDTA , reactivos de sulfhidrilo , así como inhibidores de tripsina o quimotripsina . La proteinasa K se utiliza para la destrucción de proteínas en lisados celulares (tejido, células de cultivo celular) y para la liberación de ácidos nucleicos, ya que inactiva de manera muy eficaz las ADNas y ARNas. Algunos ejemplos de aplicaciones: La proteinasa K es muy útil en el aislamiento de ADN o ARN altamente nativos y sin daños, ya que la mayoría de las ADNas y ARNas microbianas o de mamíferos son inactivadas rápidamente por la enzima, particularmente en presencia de 0,5-1% de SDS.
La actividad de la enzima hacia las proteínas nativas se estimula con desnaturalizantes como el SDS. Por el contrario, cuando se mide utilizando sustratos peptídicos , los desnaturalizantes inhiben la enzima. La razón de este resultado es que los agentes desnaturalizantes desdoblan los sustratos proteicos y los hacen más accesibles a la proteasa. [8]
La proteinasa K tiene dos enlaces disulfuro, [9] pero exhibe una mayor actividad proteolítica en presencia de agentes reductores (por ejemplo, 5 mM DTT ), [10] lo que sugiere que la presunta reducción de sus propios enlaces disulfuro no conduce a su inactivación irreversible. La proteinasa K es inhibida por inhibidores de serina proteasa como el fluoruro de fenilmetilsulfonilo ( PMSF ), el diisopropilfluorofosfato ( DFP ) o el fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo ( AEBSF ). La actividad de la proteinasa K no se ve afectada por los reactivos modificadores de sulfhidrilo: ácido para-cloromercuribenzoico ( PCMB ), N-alfa-tosil-L-lisil-clorometil-cetona (TLCK) o N-alfa-tosil-l-fenilalanina clorometil cetona ( TPCK ), [10] aunque presumiblemente si estos reactivos se incluyeran junto con reactivos reductores de disulfuro que expusieran los tioles de la proteinasa K típicamente no disponibles, entonces podría inhibirse.
