En genética , el ADN complementario ( ADNc ) es ADN que se transcribió de forma inversa (mediante transcriptasa inversa ) a partir de un ARN (p. ej., ARN mensajero o microARN ). El ADNc existe tanto en forma monocatenaria como bicatenaria y en forma natural y artificial.
En formas diseñadas, a menudo es una copia (réplica) del ADN natural del genoma natural de cualquier organismo en particular; El propio ARNm del organismo se transcribió naturalmente a partir de su ADN, y el ADNc se transcribió de forma inversa a partir del ARNm, lo que produjo un duplicado del ADN original. El ADNc diseñado a menudo se utiliza para expresar una proteína específica en una célula que normalmente no expresa esa proteína (es decir, expresión heteróloga ), o para secuenciar o cuantificar moléculas de ARNm utilizando métodos basados en ADN (qPCR, RNA-seq). El ADNc que codifica una proteína específica puede transferirse a una célula receptora para su expresión como parte de ADN recombinante , a menudo sistemas de expresión bacterianos o de levaduras. [1] El ADNc también se genera para analizar perfiles transcriptómicos en tejido masivo, células individuales o núcleos individuales en ensayos como microarrays , qPCR y RNA-seq .
En formas naturales, el ADNc es producido por retrovirus (como el VIH-1 , el VIH-2 , el virus de la inmunodeficiencia simia , etc.) y luego se integra en el genoma del huésped, donde crea un provirus . [2]
El término ADNc también se utiliza, normalmente en un contexto bioinformático , para referirse a la secuencia de una transcripción de ARNm, expresada como bases de ADN (desoxi-GCAT) en lugar de bases de ARN (GCAU).
La patentabilidad del ADNc fue un tema de una decisión de la Corte Suprema de EE. UU. de 2013 en Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics, Inc. Como compromiso, el Tribunal declaró que los exones (solo el ADNc) son elegibles para patente, mientras que las secuencias aisladas de ADN natural que comprenden intrones no lo son.
El ARN sirve como plantilla para la síntesis de ADNc. [3] En la vida celular, el ADNc es generado por virus y retrotransposones para la integración del ARN en el ADN genómico objetivo . En biología molecular, el ARN se purifica a partir del material original después de que se eliminan el ADN genómico, las proteínas y otros componentes celulares. Luego, el ADNc se sintetiza mediante transcripción inversa in vitro . [4]
El ARN se transcribe a partir del ADN genómico en las células huésped y se extrae primero lisando las células y luego purificando el ARN utilizando métodos ampliamente utilizados, como el fenol-cloroformo, la columna de sílice y los métodos de extracción de ARN basados en perlas. [5] Los métodos de extracción varían según el material de origen. Por ejemplo, la extracción de ARN de tejido vegetal requiere reactivos adicionales, como la polivinilpirrolidona (PVP), para eliminar compuestos fenólicos, carbohidratos y otros compuestos que, de otro modo, inutilizarían el ARN. [6] Para eliminar el ADN y las proteínas, se utilizan enzimas como la ADNasa y la proteinasa K para la degradación. [7] Es importante destacar que la integridad del ARN se mantiene mediante la inactivación de las ARNasas con agentes caotrópicos como el isotiocianato de guanidinio, el dodecilsulfato de sodio (SDS), el fenol o el cloroformo. Luego se separa el ARN total de otros componentes celulares y se precipita con alcohol. Existen varios kits comerciales para extracciones de ARN sencillas y rápidas para aplicaciones específicas. [8] Se pueden utilizar métodos adicionales basados en perlas para aislar subtipos específicos de ARN (por ejemplo, ARNm y microARN ) según el tamaño o las regiones únicas del ARN. [9] [10]
Utilizando una enzima transcriptasa inversa y plantillas de ARN purificadas, se produce una cadena de ADNc (síntesis de la primera cadena de ADNc). La transcriptasa inversa M-MLV del virus de la leucemia murina de Moloney se usa comúnmente debido a su actividad reducida de RNasa H, adecuada para la transcripción de ARN más largos. [11] La transcriptasa inversa AMV del virus de la mieloblastosis aviar también se puede utilizar para plantillas de ARN con estructuras secundarias fuertes (es decir, alta temperatura de fusión). [12] El ADNc se genera comúnmente a partir de ARNm para análisis de expresión génica como RT-qPCR y RNA-seq . [13] El ARNm se transcribe de forma inversa selectivamente utilizando cebadores oligo-d T que son el complemento inverso de la cola poliadenilada en el extremo 3' de todo el ARNm. El cebador oligo-dT se hibrida con la cola poliadenilada del ARNm para servir como sitio de unión para que la transcriptasa inversa comience la transcripción inversa. Una mezcla optimizada de oligo-dT y cebadores hexámeros aleatorios aumenta la posibilidad de obtener ADNc de longitud completa al tiempo que reduce el sesgo 5' o 3'. [14] El ARN ribosómico también se puede agotar para enriquecer tanto el ARNm como los transcritos no poliadenilados, como algunos ARN no codificantes . [15]
El resultado de la síntesis de la primera cadena, los híbridos de ARN-ADN, puede procesarse mediante múltiples métodos de síntesis de la segunda cadena o procesarse directamente en ensayos posteriores. [16] [17] Uno de los primeros métodos conocido como síntesis cebada en horquilla se basaba en la formación de horquillas en el extremo 3' del ADNc de la primera hebra para cebar la síntesis de la segunda hebra. Sin embargo, el cebado es aleatorio y la hidrólisis en horquilla conduce a la pérdida de información. El procedimiento de Gubler y Hoffman utiliza E. Coli RNase H para cortar el ARNm que se reemplaza con E. Coli DNA Polymerase I y se sella con E. Coli DNA Ligase . Una optimización de este procedimiento se basa en la baja actividad de la RNasa H de M-MLV para cortar el ARNm y el ARN restante se elimina posteriormente añadiendo RNasa H después de la traducción de la ADN polimerasa del ADNc de la segunda cadena. Esto evita la pérdida de información de secuencia en el extremo 5' del ARNm.
El ADN complementario se utiliza a menudo en la clonación de genes , como sondas genéticas o en la creación de una biblioteca de ADNc . Cuando los científicos transfieren un gen de una célula a otra para expresar el nuevo material genético como una proteína en la célula receptora, el ADNc se agregará al receptor (en lugar de todo el gen), porque el ADN de un gen completo puede incluir ADN que no codifica la proteína o que interrumpe la secuencia codificante de la proteína (p. ej., intrones ). Las secuencias parciales de ADNc se obtienen a menudo como etiquetas de secuencia expresadas .
Ahora que la amplificación de secuencias de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es algo común, normalmente se realizará una transcripción inversa como paso inicial, seguida de una PCR para obtener una secuencia exacta de ADNc para la expresión intracelular. Esto se logra diseñando cebadores de ADN específicos de secuencia que se hibridan con los extremos 5' y 3' de una región de ADNc que codifica una proteína. Una vez amplificada, la secuencia puede cortarse en cada extremo con nucleasas e insertarse en una de las muchas pequeñas secuencias circulares de ADN conocidas como vectores de expresión. Dichos vectores permiten la autorreplicación dentro de las células y potencialmente la integración en el ADN del huésped. Por lo general, también contienen un fuerte promotor para impulsar la transcripción del ADNc objetivo en ARNm, que luego se traduce en proteína.
El ADNc también se utiliza para estudiar la expresión génica mediante métodos como RNA-seq o RT-qPCR . [18] [19] [20] Para la secuenciación, el ARN debe fragmentarse debido a las limitaciones del tamaño de la plataforma de secuenciación. Además, el ADNc sintetizado de segunda cadena debe ligarse con adaptadores que permitan que los fragmentos de ADNc se amplifiquen por PCR y se unan a las células de flujo de secuenciación. Los métodos de análisis específicos de genes suelen utilizar microarrays y RT-qPCR para cuantificar los niveles de ADNc mediante métodos fluorométricos y de otro tipo.
El 13 de junio de 2013, la Corte Suprema de los Estados Unidos dictaminó en el caso Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics que, si bien los genes naturales no pueden patentarse , el ADNc sí puede patentarse porque no se produce de forma natural. [21]
Algunos virus también utilizan ADNc para convertir su ARN viral en ARNm (ARN viral → ADNc → ARNm). El ARNm se utiliza para producir proteínas virales que se apoderan de la célula huésped.
Un ejemplo de este primer paso del ARN viral al ADNc se puede ver en el ciclo de infección del VIH. Aquí, la membrana de la célula huésped se une a la envoltura lipídica del virus, lo que permite que la cápside viral con dos copias del ARN del genoma viral ingrese al huésped. Luego, la copia del ADNc se realiza mediante la transcripción inversa del ARN viral, un proceso facilitado por la chaperona CypA y una transcriptasa inversa asociada a la cápsida viral. [22]
El ADNc también se genera mediante retrotransposones en genomas eucariotas. Los retrotransposones son elementos genéticos móviles que se mueven dentro de los genomas y, a veces, entre ellos a través de intermediarios de ARN. Este mecanismo es compartido con los virus con exclusión de la generación de partículas infecciosas. [23] [24]
Mark D. Adams y otros. "Secuenciación complementaria de ADN: etiquetas de secuencia expresada y proyecto del genoma humano". Ciencia (Asociación Estadounidense para el Avance de la Ciencia) 252.5013 (1991): 1651–1656. Web.
Philip M. Murphy y H. Lee Tiffany. "Clonación de ADN complementario que codifica un receptor de interleucina-8 humano funcional". Ciencia (Asociación Estadounidense para el Avance de la Ciencia) 253.5025 (1991): 1280–1283. Web.