La clorofilasa es una enzima esencial en el metabolismo de la clorofila . Es una proteína de membrana conocida comúnmente como clasa (EC 3.1.1.14, CLH ) con el nombre sistemático de clorofila clorofilidohidrolasa . Cataliza la reacción
La clorofilasa se puede encontrar en el cloroplasto , la membrana tilacoide y el etioplasto de al menos plantas superiores como helechos, musgos, algas pardas y rojas y diatomeas. La clorofilasa es el catalizador de la hidrólisis de la clorofila para producir clorofilida (también llamada clorofila) y fitol . También se sabe que funciona en la esterificación de clorofila y la transesterificación . La enzima funciona óptimamente a pH 8,5 y 50 °C. [1] [2] [3]
La clorofila es de gran importancia para todos los organismos fotosintéticos , por lo que su síntesis y descomposición están estrechamente reguladas a lo largo de todo el ciclo de vida de la planta. La descomposición de la clorofila es más evidente en los cambios estacionales, cuando las plantas pierden su color verde en otoño; también es evidente en la maduración de los frutos, la senescencia de las hojas y la floración. En este primer paso, la clorofilasa inicia el catabolismo de la clorofila para formar clorofilida. La degradación de la clorofila se produce en el recambio de la clorofila, así como en caso de muerte celular causada por lesiones, ataques patógenos y otros factores externos.
La clorofilasa tiene una doble función, ya que interviene en ambos procesos de desverdización, como la coloración otoñal, y también se cree que está implicada en la renovación y la homeostasis de las clorofilas. La catálisis de la clorofila en el paso inicial de la degradación de la clorofila es importante para el desarrollo y la supervivencia de las plantas. La degradación sirve como requisito previo para la desintoxicación de la clorofila y de los intermediarios de la clorofila potencialmente fototóxicos, ya que acompaña a la senescencia de las hojas hasta convertirse en catabolitos no fluorescentes. Por lo tanto, la degradación rápida de la clorofila y de sus intermediarios es necesaria para evitar el daño celular debido a la posible fototoxicidad de la clorofila. [4] [5] [6]
La clorofilasa cataliza la hidrólisis del enlace éster para producir clorofilida y fitol. Reacciona mediante transesterificación o hidrólisis de un éster carboxílico en el que sus sustratos naturales son 13-OH-clorofila a, bacterioclorofila y clorofila a.
La hidrólisis de la clorofila comienza con el ataque de un grupo carbonilo de la clorofila por el oxígeno del grupo hidroxilo del residuo crucial de serina de la clorofilasa. Este ataque forma un estado de transición tetraédrico. El doble enlace del carbonilo atacado se reforma y la serina se esterifica a clorofilida. El grupo fitol abandona el compuesto y reemplaza al residuo de serina en la enzima clorofilasa. La adición de agua a la reacción separa el fitol de la enzima. A continuación, a través de la reacción inversa, el oxígeno del grupo hidroxilo del agua en el paso anterior ataca al carbonilo del intermediario para formar otro estado de transición tetraédrico. El doble enlace del carbonilo se forma de nuevo y el residuo de serina regresa a la clorofilasa y el éster de la clorofila es ahora un ácido carboxílico. Este producto es clorofilida. [7]
La clorofilida se descompone luego en feoforbida a . Después de que se forma la feoforbida a, el anillo de porfirina es escindido por la feoforbida a oxigenasa (PAO) para formar RCC (catabolito rojo de clorofila) haciendo que la planta pierda su color verde. Luego, el RCC se descompone en pFCC. [8]
Citrus sinensis y Chenopodium album fueron las primeras plantas de las que se aislaron los genes que codifican la clorofilasa. Estos experimentos revelaron una secuencia codificada poco característica (21 aminoácidos en Citrus sinensis y 30 aminoácidos en Chenopodium album ) ubicada en el extremo N que estaba ausente de la proteína madura. La enzima clorofilasa es una opción inteligente como enzima limitante de la velocidad de la vía catabólica desde el desverdizado y la expresión de la clorofilasa se induce en Citrus tratado con etileno . Sin embargo, datos recientes sugieren que la clorofilasa se expresa en niveles bajos durante el desarrollo natural del fruto, cuando generalmente tiene lugar el catabolismo de la clorofila. Además, algunos datos sugieren que la actividad de la clorofilasa no es consistente con el desverdizado durante la senescencia natural. Finalmente, hay evidencia de que se ha encontrado clorofilasa en la membrana de la envoltura interna del cloroplasto, donde no entra en contacto con la clorofila. Estudios recientes inspirados en datos inconsistentes revelaron que la clorofilasa en Citrus que carece de la secuencia de 21 aminoácidos en el extremo N-terminal da como resultado una extensa degradación de la clorofila y el efecto de desverdización que debería ocurrir in vivo . Esta escisión ocurre en la fracción de membrana del cloroplasto. Sin embargo, tanto la clorofilasa completa como la clorofilasa madura escindida experimentaron niveles similares de actividad en un ensayo in vitro . Estos datos sugieren que la proteína madura entra en contacto con su sustrato más fácilmente debido a la secuencia N-terminal y ocurre cierta regulación natural que afecta directamente la actividad enzimática. Otra posibilidad es que los compartimentos de los suborganelos se descompongan, lo que permite una mayor cantidad de actividad enzimática. [9]
La clorofilida, producto de la reacción catalizada por la clorofilasa, se combina espontáneamente con lípidos vegetales como los liposomas de fosfatidilcolina junto con el sulfoquinovosil diacilglicerol . Estos dos lípidos inhiben cooperativamente la actividad de la clorofilasa, pero esta inhibición puede revertirse con la presencia de Mg++, un catión divalente. [10] La actividad de la clorofilasa también depende del pH y del contenido iónico del medio. Los valores de kcat y kcat/Km de la clorofilasa en presencia de clorofila mostraron valores de pKa de 6,3 y 6,7, respectivamente. La temperatura también afecta a la actividad de la clorofilasa. La clorofilasa del trigo es activa de 25 a 75 °C. La enzima se inactiva a temperaturas superiores a los 85 °C. La clorofilasa del trigo es estable 20 °C más que otras clorofilasas. Estas otras clorofilasas pueden permanecer activas a temperaturas de hasta 55 °C. [11]
El etileno induce la síntesis de clorofilasa y promueve el desverdizado de los frutos cítricos. Se detectó clorofilasa en extractos proteicos de frutos tratados con etileno. En los frutos tratados con etileno, la actividad de la clorofilasa aumentó cinco veces en 24 horas. El etileno, más específicamente, induce mayores tasas de transcripción del gen de la clorofilasa. [12] [13]
También hay evidencia de un dominio de lipasa de serina altamente conservado en la enzima clorofilasa que contiene un residuo de serina que es esencial para la actividad enzimática. Los residuos de histidina y ácido aspártico también son parte de la tríada catalítica de la clorofilasa como una serina hidrolasa . Por lo tanto, los inhibidores específicos para el mecanismo de la serina hidrolasa inhiben eficazmente la enzima clorofilasa. Además, las mutaciones en estos residuos de aminoácidos específicos causan la pérdida completa de la función ya que las mutaciones cambian el sitio catalítico de la enzima clorofilasa. [7]
