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Síntesis de oligonucleótidos

La síntesis de oligonucleótidos es la síntesis química de fragmentos relativamente cortos de ácidos nucleicos con una estructura química definida ( secuencia ). La técnica es extremadamente útil en la práctica de laboratorio actual porque proporciona un acceso rápido y económico a oligonucleótidos hechos a medida de la secuencia deseada. Mientras que las enzimas sintetizan ADN y ARN solo en una dirección de 5' a 3' , la síntesis química de oligonucleótidos no tiene esta limitación, aunque se lleva a cabo con mayor frecuencia en la dirección opuesta, de 3' a 5'. Actualmente, el proceso se implementa como síntesis en fase sólida utilizando el método de fosforamidita y bloques de construcción de fosforamidita derivados de 2'-desoxinucleósidos protegidos ( dA , dC , dG y T ), ribonucleósidos ( A , C , G y U ) o nucleósidos modificados químicamente, por ejemplo, LNA o BNA .

Para obtener el oligonucleótido deseado, los bloques de construcción se acoplan secuencialmente a la cadena de oligonucleótidos en crecimiento en el orden requerido por la secuencia del producto (ver Ciclo sintético a continuación). El proceso ha sido completamente automatizado desde finales de la década de 1970. Una vez completado el ensamblaje de la cadena, el producto se libera de la fase sólida a la solución, se desprotege y se recolecta. La aparición de reacciones secundarias establece límites prácticos para la longitud de los oligonucleótidos sintéticos (hasta aproximadamente 200 residuos de nucleótidos ) porque el número de errores se acumula con la longitud del oligonucleótido que se está sintetizando. [1] Los productos a menudo se aíslan mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para obtener los oligonucleótidos deseados con alta pureza. Por lo general, los oligonucleótidos sintéticos son moléculas de ADN o ARN monocatenario de alrededor de 15 a 25 bases de longitud.

Los oligonucleótidos encuentran una variedad de aplicaciones en la biología molecular y la medicina. Se utilizan más comúnmente como oligonucleótidos antisentido , ARN interferente pequeño , cebadores para la secuenciación y amplificación de ADN , sondas para detectar ADN o ARN complementarios mediante hibridación molecular , herramientas para la introducción dirigida de mutaciones y sitios de restricción y para la síntesis de genes artificiales . Una aplicación emergente de la síntesis de oligonucleótidos es la recreación de virus a partir de la secuencia únicamente, ya sean inofensivos, como Phi X 174 , o peligrosos, como el virus de la influenza de 1917 o el SARS-CoV-2 .

Historia

La evolución de la síntesis de oligonucleótidos vio cuatro métodos principales de formación de enlaces internucleosídicos y ha sido revisada en la literatura con gran detalle. [2] [3] [4]

Trabajos tempranos y síntesis contemporánea de H-fosfonato

Esquema. 1. i : N -Clorosuccinimida; Bn = -CH 2 Ph

A principios de la década de 1950, el grupo de Alexander Todd fue pionero en los métodos de síntesis de oligonucleótidos con H-fosfonato y triéster de fosfato . [5] [6] La reacción de los compuestos 1 y 2 para formar el diéster de H-fosfonato 3 es un acoplamiento de H-fosfonato en solución, mientras que la de los compuestos 4 y 5 para dar 6 es un acoplamiento de fosfotriéster (ver síntesis de fosfotriéster a continuación).

Esquema 2. Síntesis de oligonucleótidos por el método del H-Fosfonato

Treinta años después, este trabajo inspiró, de forma independiente, a dos grupos de investigación a adoptar la química del H-fosfonato para la síntesis en fase sólida utilizando monoésteres de nucleósido H-fosfonato 7 como bloques de construcción y cloruro de pivaloilo, cloruro de 2,4,6-triisopropilbencenosulfonilo (TPS-Cl) y otros compuestos como activadores. [7] [8] La implementación práctica del método del H-fosfonato dio como resultado un ciclo sintético muy corto y simple que consta de solo dos pasos, destritilación y acoplamiento (Esquema 2). La oxidación de los enlaces diéster internucleosídicos del H-fosfonato en 8 a enlaces fosfodiéster en 9 con una solución de yodo en piridina acuosa se lleva a cabo al final del ensamblaje de la cadena en lugar de como un paso en el ciclo sintético. Si se desea, la oxidación se puede llevar a cabo en condiciones anhidras. [9] Alternativamente, 8 puede convertirse en fosforotioato 10 [10] [11] [12] [13] o fosforoselenoato 11 (X = Se), [14] u oxidarse mediante CCl 4 en presencia de aminas primarias o secundarias a análogos de fosforamidato 12 . [15] [16] El método es muy conveniente ya que se pueden introducir varios tipos de modificaciones de fosfato (fosfato/fosforotioato/fosforamidato) en el mismo oligonucleótido para modular sus propiedades. [17] [18] [19]

En la mayoría de los casos, los bloques de construcción de H-fosfonato están protegidos en el grupo 5'-hidroxi y en el grupo amino de las bases nucleicas A, C y G de la misma manera que los bloques de construcción de fosforamidita (ver a continuación). Sin embargo, la protección en el grupo amino no es obligatoria. [9] [20]

Síntesis de fosfodiésteres

Esquema 3 Acoplamiento de oligonucleótidos por el método del fosfodiéster; Tr = -CPh 3

En la década de 1950, Har Gobind Khorana y colaboradores desarrollaron un método de fosfodiéster en el que el 3'- O -acetilnucleósido-5'- O -fosfato 2 (Esquema 3) se activaba con N , N ' -diciclohexilcarbodiimida (DCC) o cloruro de 4-toluenosulfonilo (Ts-Cl). Las especies activadas se hicieron reaccionar con un nucleósido 1 protegido en 5'- O para dar un dinucleósido monofosfato protegido 3 . [21] Tras la eliminación del grupo 3'- O -acetilo mediante hidrólisis catalizada por bases, se llevó a cabo una mayor elongación de la cadena. Siguiendo esta metodología, se sintetizaron conjuntos de tri- y tetradesoxirribonucleótidos y se convirtieron enzimáticamente en oligonucleótidos más largos, lo que permitió la elucidación del código genético . La principal limitación del método del fosfodiéster consistía en la formación de oligómeros de pirofosfato y oligonucleótidos ramificados en el fosfato internucleosídico. El método parece ser un paso atrás con respecto a la química más selectiva descrita anteriormente; sin embargo, en ese momento, la mayoría de los grupos protectores de fosfato disponibles en la actualidad aún no se habían introducido. La falta de una estrategia de protección conveniente hizo necesario recurrir a una química más lenta y menos selectiva para lograr el objetivo final del estudio. [2]

Síntesis de fosfotriésteres

Esquema 4. Acoplamiento de oligonucleótidos por el método del fosfotriéster; MMT = -CPh 2 (4-MeOC 6 H 4 ).

En la década de 1960, los grupos dirigidos por R. Letsinger [22] y C. Reese [23] desarrollaron un método de fosfotriéster. La diferencia definitoria con respecto al método de fosfodiéster fue la protección de la fracción de fosfato en el bloque de construcción 1 (Esquema 4) y en el producto 3 con el grupo 2-cianoetilo . Esto impidió la formación de oligonucleótidos ramificados en el fosfato internucleosídico. La mayor selectividad del método permitió el uso de agentes de acoplamiento y catalizadores más eficientes, [24] [25] lo que redujo drásticamente la duración de la síntesis. El método, desarrollado inicialmente para la síntesis en fase de solución, también se implementó en poliestireno "palomitas de maíz" de baja reticulación, [26] y más tarde en vidrio de poro controlado (CPG, consulte "Material de soporte sólido" a continuación), lo que inició un esfuerzo de investigación masivo en la síntesis en fase sólida de oligonucleótidos y finalmente condujo a la automatización del ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos.

Síntesis de triésteres de fosfito

En la década de 1970, se utilizaron con éxito derivados de nucleósidos P(III) sustancialmente más reactivos, los 3'- O -clorofosfitos, para la formación de enlaces internucleosídicos. [27] Esto condujo al descubrimiento de la metodología del triéster de fosfito . El grupo dirigido por M. Caruthers aprovechó los 1 H -tetrazolidofosfitos menos agresivos y más selectivos e implementó el método en fase sólida. [28] Muy poco después, los trabajadores del mismo grupo mejoraron aún más el método utilizando fosforamiditas de nucleósidos más estables como bloques de construcción. [29] El uso del grupo protector de fosfito de 2-cianoetilo [30] en lugar de un grupo metilo menos fácil de usar [31] [32] condujo a las fosforamiditas de nucleósidos que se utilizan actualmente en la síntesis de oligonucleótidos (ver Bloques de construcción de fosforamiditas a continuación). Muchas mejoras posteriores en la fabricación de bloques de construcción, sintetizadores de oligonucleótidos y protocolos sintéticos hicieron de la química de la fosforamidita un método de elección muy confiable y conveniente para la preparación de oligonucleótidos sintéticos. [1]

Síntesis por el método de la fosforamidita

Bloques de construcción

Fosforamiditas de nucleósidos

Fosforamiditas de 2'-desoxinucleósido protegidas.

Como se mencionó anteriormente, los nucleótidos naturales (nucleósido-3'- o 5'-fosfatos) y sus análogos fosfodiésteres no son lo suficientemente reactivos para proporcionar una preparación sintética rápida de oligonucleótidos con altos rendimientos. La selectividad y la tasa de formación de enlaces internucleosídicos se mejoran drásticamente mediante el uso de derivados de nucleósidos 3'- O -( N , N -diisopropil fosforamidita) (fosforamiditas de nucleósidos) que sirven como bloques de construcción en la metodología de triéster de fosfito. Para evitar reacciones secundarias no deseadas, todos los demás grupos funcionales presentes en los nucleósidos deben volverse no reactivos (protegidos) mediante la unión de grupos protectores . Una vez completado el ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos, todos los grupos protectores se eliminan para producir los oligonucleótidos deseados. A continuación, se revisan brevemente los grupos protectores que se utilizan actualmente en los bloques de construcción de fosforamidita de nucleósidos disponibles comercialmente [33] [34] [35] [36] y los más comunes:

La protección de los grupos amino exocíclicos tiene que ser ortogonal a la del grupo 5'-hidroxi, ya que este último se elimina al final de cada ciclo sintético. La estrategia más sencilla de implementar, y por lo tanto la más utilizada, es instalar un grupo protector lábil a las bases en los grupos amino exocíclicos. Lo más frecuente es que se utilicen dos esquemas de protección.

Fosforamiditas de ribonucleósido 2'- O -protegidas.

Fosforamiditas no nucleósidas

Fosforamiditas no nucleósidas para la modificación 5' de oligonucleótidos sintéticos. MMT = mono-metoxitritilo,(4-metoxifenil)difenilmetilo.

Las fosforamiditas no nucleosídicas son reactivos de fosforamidita diseñados para introducir diversas funcionalidades en los extremos de oligonucleótidos sintéticos o entre residuos de nucleótidos en el medio de la secuencia. Para poder introducirse dentro de la secuencia, un modificador no nucleosídico debe poseer al menos dos grupos hidroxi, uno de los cuales suele estar protegido con el grupo DMT mientras que el otro lleva la fracción reactiva de fosforamidita.

Las fosforamiditas no nucleosídicas se utilizan para introducir grupos deseados que no están disponibles en los nucleósidos naturales o que pueden introducirse más fácilmente utilizando diseños químicos más simples. En el esquema se muestra una selección muy breve de reactivos de fosforamiditas comerciales para demostrar la diversidad estructural y funcional disponible. Estos reactivos sirven para la unión de fosfato 5'-terminal ( 1 ), [52] NH 2 ( 2 ), [53] SH ( 3 ), [54] aldehído ( 4 ), [55] y grupos carboxílicos ( 5 ), [56] triples enlaces CC ( 6 ), [57] marcadores no radiactivos y extintores (ejemplificados por 6-FAM amidita 7 [58] para la unión de fluoresceína y dabcyl amidite 8 , [59] respectivamente), modificadores hidrófilos e hidrófobos (ejemplificados por hexaetilenglicol amidite 9 [60] [61] y colesterol amidite 10 , [62] respectivamente), y biotina amidite 11 . [63]

Ciclo de síntesis

Esquema 5. Ciclo de síntesis para la preparación de oligonucleótidos por el método de fosforamidita.

La síntesis de oligonucleótidos se lleva a cabo mediante la adición gradual de residuos de nucleótidos al extremo 5' de la cadena en crecimiento hasta que se ensambla la secuencia deseada. Cada adición se denomina ciclo de síntesis (Esquema 5) y consta de cuatro reacciones químicas:

Paso 1: Desbloqueo (destritilación)

El grupo DMT se elimina con una solución de un ácido, como ácido tricloroacético (TCA) al 2% o ácido dicloroacético (DCA) al 3%, en un disolvente inerte ( diclorometano o tolueno ). El catión DMT de color naranja formado se elimina por lavado; el paso da como resultado que el precursor de oligonucleótido unido al soporte sólido tenga un grupo hidroxilo 5'-terminal libre. Vale la pena recordar que realizar la destritilación durante un tiempo prolongado o con soluciones de ácidos más fuertes que las recomendadas conduce a la despurinización del oligonucleótido unido al soporte sólido y, por lo tanto, reduce el rendimiento del producto de longitud completa deseado. [ cita requerida ]

Paso 2: Acoplamiento

Una solución 0,02–0,2 M de fosforamidita de nucleósido (o una mezcla de varias fosforamiditas) en acetonitrilo se activa con una solución 0,2–0,7 M de un catalizador de azol ácido, 1 H -tetrazol , 5-etiltio-1H-tetrazol, [64] 2-benciltiotetrazol, [65] [66] 4,5-diciano imidazol , [67] o una serie de compuestos similares. Se puede encontrar una información más extensa sobre el uso de varios agentes de acoplamiento en la síntesis de oligonucleótidos en una revisión reciente. [68] La mezcla suele ser muy breve y se produce en líneas de fluido de sintetizadores de oligonucleótidos (ver más abajo) mientras los componentes se envían a los reactores que contienen soporte sólido. El fosforamidito activado en un exceso de 1,5 a 20 veces sobre el material unido al soporte se pone entonces en contacto con el soporte sólido de partida (primer acoplamiento) o un precursor oligonucleótido unido al soporte (acoplamientos posteriores) cuyo grupo 5'-hidroxi reacciona con la fracción fosforamidita activada del fosforamidito nucleósido entrante para formar un enlace triéster fosfito. El acoplamiento de fosforamiditos 2'-desoxinucleósidos es muy rápido y requiere, a pequeña escala, unos 20 s para su finalización. Por el contrario, los fosforamiditos ribonucleósidos 2'- O -protegidos estéricamente impedidos requieren de 5 a 15 min para acoplarse con altos rendimientos. [47] [69] [70] [71] La reacción también es muy sensible a la presencia de agua, en particular cuando se utilizan soluciones diluidas de fosforamiditos, y se lleva a cabo habitualmente en acetonitrilo anhidro. En general, cuanto mayor sea la escala de la síntesis, menor será el exceso y mayor la concentración de fosforamiditas utilizadas. Por el contrario, la concentración del activador está determinada principalmente por su solubilidad en acetonitrilo y es independiente de la escala de la síntesis. Una vez finalizado el acoplamiento, los reactivos y subproductos no unidos se eliminan mediante lavado.

Paso 3: Tapado

La etapa de recubrimiento se realiza tratando el material unido al soporte sólido con una mezcla de anhídrido acético y 1-metilimidazol o, con menor frecuencia, DMAP como catalizadores y, en el método de fosforamidita, cumple dos propósitos.

Paso 4: Oxidación

El enlace triéster de fosfito tricoordinado recién formado no es natural y tiene una estabilidad limitada en las condiciones de la síntesis de oligonucleótidos. El tratamiento del material unido al soporte con yodo y agua en presencia de una base débil (piridina, lutidina o colidina ) oxida el triéster de fosfito en un triéster de fosfato tetracoordinado, un precursor protegido del enlace internucleosídico de diéster de fosfato de origen natural. La oxidación se puede llevar a cabo en condiciones anhidras utilizando hidroperóxido de terc-butilo [74] o, de forma más eficiente, (1S)-(+)-(10-canforsulfonil)-oxaziridina (CSO). [75] [76] [77] El paso de oxidación se puede sustituir por un paso de sulfuración para obtener fosforotioatos de oligonucleótidos (véase Fosforotioatos de oligonucleótidos y su síntesis a continuación). En el último caso, es mejor realizar el paso de sulfuración antes del tapado.

Soportes sólidos

En la síntesis en fase sólida, un oligonucleótido que se está ensamblando se une covalentemente , a través de su grupo hidroxi 3'-terminal, a un material de soporte sólido y permanece unido a él durante todo el transcurso del ensamblaje de la cadena. El soporte sólido está contenido en columnas cuyas dimensiones dependen de la escala de síntesis y pueden variar entre 0,05  mL y varios litros. La abrumadora mayoría de oligonucleótidos se sintetizan a pequeña escala que varía de 10 n mol a 1 μmol. Más recientemente, la síntesis de oligonucleótidos de alto rendimiento donde el soporte sólido está contenido en los pocillos de placas de múltiples pocillos (más a menudo, 96 o 384 pocillos por placa) se convirtió en un método de elección para la síntesis paralela de oligonucleótidos a pequeña escala. [78] Al final del ensamblaje de la cadena, el oligonucleótido se libera del soporte sólido y se eluye de la columna o el pocillo.

Material de soporte sólido

A diferencia de la síntesis orgánica en fase sólida y la síntesis de péptidos , la síntesis de oligonucleótidos se realiza mejor en soportes sólidos no hinchables o poco hinchables. Los dos materiales en fase sólida más utilizados son el vidrio de poro controlado (CPG) y el poliestireno macroporoso (MPPS). [79]

Química de los enlaces

Soportes sólidos comerciales para la síntesis de oligonucleótidos.
Esquema 6. Mecanismo de 3'-desfosforilación de oligonucleótidos ensamblados sobre soportes sólidos universales.

Para que el material de soporte sólido sea adecuado para la síntesis de oligonucleótidos, se unen de forma covalente enlaces no nucleosídicos o succinatos de nucleósidos a los grupos amino reactivos en aminopropil CPG, LCAA CPG o aminometil MPPS. Los grupos amino que no han reaccionado restantes se protegen con anhídrido acético . Normalmente, se utilizan tres grupos conceptualmente diferentes de soportes sólidos.

Fosforotioatos de oligonucleótidos y su síntesis

Enlaces fosforotioato internucleosídicos diastereoméricos Sp y Rp .

Los fosforotioatos de oligonucleótidos (OPS) son oligonucleótidos modificados en los que uno de los átomos de oxígeno en la fracción de fosfato se reemplaza por azufre. Solo los fosforotioatos que tienen azufre en una posición sin puente como se muestra en la figura se usan ampliamente y están disponibles comercialmente. El reemplazo del oxígeno sin puente por azufre crea un nuevo centro de quiralidad en el fósforo . En un caso simple de un dinucleótido, esto da como resultado la formación de un par diastereomérico de monofosforotioatos de dinucleósido Sp y R p cuyas estructuras se muestran en la Figura. En un oligonucleótido n -mero donde todos los enlaces internucleosídicos ( n  – 1) son enlaces fosforotioato, el número de diastereómeros m se calcula como m = 2 ( n  – 1) . Al ser análogos no naturales de los ácidos nucleicos, los OPS son sustancialmente más estables a la hidrólisis por nucleasas , la clase de enzimas que destruyen los ácidos nucleicos al romper el enlace PO de puente de la fracción fosfodiéster. Esta propiedad determina el uso de OPS como oligonucleótidos antisentido en aplicaciones in vitro e in vivo donde la exposición extensa a las nucleasas es inevitable. De manera similar, para mejorar la estabilidad del ARNi , a menudo se introduce al menos un enlace fosforotioato en el extremo 3' de las cadenas sentido y antisentido. En OPS quiralmente puro, los diastereómeros all-Sp son más estables a la degradación enzimática que sus análogos all-Rp. [91] Sin embargo, la preparación de OPS quiralmente puro sigue siendo un desafío sintético. [13] [92] En la práctica de laboratorio, se utilizan comúnmente mezclas de diastereómeros de OPS.

La síntesis de OPS es muy similar a la de oligonucleótidos naturales. La diferencia es que el paso de oxidación se reemplaza por una reacción de transferencia de azufre (sulfurización) y que el paso de recubrimiento se realiza después de la sulfuración. De los muchos reactivos descritos capaces de realizar una transferencia de azufre eficiente, solo tres están disponibles comercialmente:

Agentes comerciales de transferencia de azufre para la síntesis de oligonucleótidos.

Automatización

En el pasado, la síntesis de oligonucleótidos se llevaba a cabo manualmente en solución o en fase sólida. La síntesis en fase sólida se implementaba utilizando, como contenedores para la fase sólida, columnas de vidrio en miniatura similares en su forma a columnas de cromatografía de baja presión o jeringas equipadas con filtros porosos. [101] Actualmente, la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida se lleva a cabo automáticamente utilizando instrumentos controlados por computadora (sintetizadores de oligonucleótidos) y se implementa técnicamente en formatos de columna, placa multipocillo y matriz. El formato de columna es el más adecuado para la investigación y aplicaciones a gran escala donde no se requiere un alto rendimiento. [102] El formato de placa multipocillo está diseñado específicamente para la síntesis de alto rendimiento a pequeña escala para satisfacer la creciente demanda de oligonucleótidos sintéticos de la industria y la academia. [103]

Historia de la síntesis de oligonucleótidos a mediana y gran escala

Los sintetizadores de oligonucleótidos a gran escala se desarrollaron a menudo aumentando las capacidades de una plataforma de instrumentos preexistente. Uno de los primeros sintetizadores de escala media apareció a fines de la década de 1980, fabricado por la empresa Biosearch en Novato, California (The 8800). Esta plataforma fue diseñada originalmente como un sintetizador de péptidos y utilizó un reactor de lecho fluidizado esencial para acomodar las características de hinchamiento de los soportes de poliestireno utilizados en la metodología Merrifield. La síntesis de oligonucleótidos implicó el uso de CPG (vidrio de poro controlado), que es un soporte rígido y es más adecuado para reactores de columna como se describió anteriormente. La escala del 8800 se limitó al caudal necesario para fluidizar el soporte. Algunos diseños de reactores novedosos, así como presiones más altas de lo normal, permitieron que el 8800 alcanzara escalas que prepararan 1 mmol de oligonucleótido. A mediados de la década de 1990, varias empresas desarrollaron plataformas que se basaban en cromatógrafos líquidos semipreparativos y preparativos. Estos sistemas eran muy adecuados para un enfoque de reactor de columna. En la mayoría de los casos, todo lo que se requirió fue aumentar la cantidad de fluidos que se podían suministrar a la columna. La síntesis de oligonucleótidos requiere un mínimo de 10 y los cromatógrafos líquidos generalmente admiten 4. Esta fue una tarea de diseño fácil y algunas estrategias semiautomáticas funcionaron sin ninguna modificación al equipo de LC preexistente. PerSeptive Biosystems, así como Pharmacia (GE), fueron dos de varias empresas que desarrollaron sintetizadores a partir de cromatógrafos líquidos. Genomic Technologies, Inc. [104] fue una de las pocas empresas que desarrolló un sintetizador de oligonucleótidos a gran escala que era, desde cero, un sintetizador de oligonucleótidos. La plataforma inicial llamada VLSS (very large scale synthetizer) utilizó grandes columnas de cromatógrafo líquido Pharmacia como reactores y podía sintetizar hasta 75 mmol de material. Muchas fábricas de síntesis de oligonucleótidos diseñaron y fabricaron sus propias plataformas personalizadas y se sabe poco debido a que los diseños son propietarios. El diseño de VLSS continuó perfeccionándose y continúa en el sintetizador QMaster [105] , que es una plataforma de menor escala que proporciona cantidades de miligramos a gramos de oligonucleótido sintético.

Recientemente se han revisado las prácticas actuales de síntesis de oligonucleótidos modificados químicamente a gran escala. [106]

Síntesis de microarrays de oligonucleótidos

Se puede visualizar una micromatriz de oligonucleótidos como una placa multipocillo en miniatura en la que se eliminan intencionalmente los separadores físicos entre los pocillos (paredes de plástico). Con respecto a la química, la síntesis de micromatrices de oligonucleótidos es diferente de la síntesis de oligonucleótidos convencional en dos aspectos:

Fosforamidita de nucleósido protegida con 5'- O -MeNPOC.

Procesamiento post-sintético

Una vez completado el ensamblaje de la cadena, el oligonucleótido unido al soporte sólido está completamente protegido:

Para proporcionar un oligonucleótido funcional, se deben eliminar todos los grupos protectores. La protección de la base N-acilo y la protección del fosfato de 2-cianoetilo pueden eliminarse, y a menudo se eliminan, simultáneamente mediante el tratamiento con bases inorgánicas o aminas. Sin embargo, la aplicabilidad de este método está limitada por el hecho de que la escisión de la protección del fosfato de 2-cianoetilo da lugar al acrilonitrilo como producto secundario. En las fuertes condiciones básicas requeridas para la eliminación de la protección N-acilo, el acrilonitrilo es capaz de alquilar las bases nucleicas, principalmente, en la posición N3 de los residuos de timina y uracilo para dar los respectivos aductos N3-(2-cianoetilo) mediante la reacción de Michael . La formación de estos productos secundarios se puede evitar tratando los oligonucleótidos unidos al soporte sólido con soluciones de bases en un disolvente orgánico, por ejemplo, con 50% de trietilamina en acetonitrilo [109] o 10% de dietilamina en acetonitrilo. [110] Este tratamiento es muy recomendable para preparaciones de mediana y gran escala y es opcional para síntesis a pequeña escala donde la concentración de acrilonitrilo generado en la mezcla de desprotección es baja.

Independientemente de si los grupos protectores de fosfato se eliminaron primero, los oligonucleótidos unidos al soporte sólido se desprotegen utilizando uno de los dos enfoques generales.

Caracterización

ES MS desconvolucionado del oligonucleótido crudo 5'-DMT-T 20 (masa calculada 6324,26 Da).

Al igual que con cualquier otro compuesto orgánico, es prudente caracterizar los oligonucleótidos sintéticos en el momento de su preparación. En casos más complejos (investigación y síntesis a gran escala), los oligonucleótidos se caracterizan después de su desprotección y después de la purificación. Aunque el enfoque definitivo para la caracterización es la secuenciación , un procedimiento relativamente económico y rutinario, las consideraciones de la reducción de costos impiden su uso en la fabricación rutinaria de oligonucleótidos. En la práctica diaria, es suficiente obtener la masa molecular de un oligonucleótido registrando su espectro de masas . Actualmente, se utilizan ampliamente dos métodos para la caracterización de oligonucleótidos: espectrometría de masas por electrospray (ESI MS) y espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción/ionización láser asistida por matriz ( MALDI-TOF ). Para obtener espectros informativos, es muy importante intercambiar todos los iones metálicos que puedan estar presentes en la muestra por iones de amonio o trialquilamonio [ ec trietilamonio, (C 2 H 5 ) 3 NH + ] antes de someter una muestra al análisis por cualquiera de los métodos.

Véase también

Referencias

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